Sejumlah kecil DNA dari Kit Ekstraksi Genom Tanaman Baru

1. Komponen kit reagen

Spesifikasi	50T	100T
Kucing. TIDAK.	SN0205	SN0206
Kolom Ekstraksi DNA (mengatur)	50 (mengatur)	100 (mengatur)
Reagen Buffer I	20 ml	2×20 ml
Penyangga Reagen II	15 ml	15 ml
Buffer Reagen C	30 ml	2 × 30 ml
Penyangga Elusi 1	15 ml	2 × 15 ml
Cuci Buffer	20 ml	20 ml
RNase A	1ml	1ml
Instruksi manual	1	1

2. Penyimpanan

Kit ini harus disimpan pada suhu kamar (15-25℃) dalam kondisi kering dan dapat disimpan 12 bulan. Kolom pemurnian ekstraksi DNA dapat disimpan di lingkungan sejuk dan kering hingga maksimal 1 tahun. RNase A mengandung bahan pengawet dan dapat diangkut pada suhu kamar, tapi untuk penyimpanan jangka panjang, itu harus dijaga pada -20℃.

 

3. Petunjuk Penggunaan Kit Reagen

3.1 Kit ini ditujukan untuk tujuan penelitian biologi molekuler dan tidak boleh digunakan untuk diagnosis atau pengobatan penyakit.

3.2 Beberapa komponen dalam kit mengandung bahan pengiritasi; disarankan untuk mengambil tindakan pencegahan yang diperlukan (seperti memakai pakaian pelindung dan kacamata).

3.3 Penggunaan kit ini memerlukan peralatan tambahan seperti centrifuge berkecepatan tinggi, mandi air (mandi logam), pencampur pusaran, etanol anhidrat, nitrogen cair, khloroform, air deionisasi steril, dan tabung EP.

4. Pengantar Kit Reagen

The new plant genome pemurnian DNA kit provides a rapid method for DNA purification. Ini secara efektif mengendapkan DNA dengan buffer reagen spesifik II dan C, mengumpulkan DNA dengan kemurnian tinggi melalui kolom adsorpsi.

Kit ini dapat diterapkan secara luas untuk mengisolasi sampel dari jaringan tanaman dan jamur, memungkinkan ekstraksi DNA total dari tanaman dan jamur di dalamnya 30 menit. Proses ekstraksi tidak melibatkan reagen beracun seperti fenol-kloroform. DNA yang diekstraksi dapat langsung digunakan untuk eksperimen hilir seperti PCR dan Southern blotting.

5. Prinsip dan Prosedur Eksperimental：

6. Proses Ekstraksi

Tindakan pencegahan sebelum memulai percobaan:

A. Reagen Buffer I dan Reagen Buffer C cenderung mengendap pada suhu rendah. Disarankan untuk memanaskannya pada suhu 65°C 5 menit sampai endapan larut sebelum penggunaan normal.

B. Sebelum menggunakan Cuci Buffer 1, tambahkan etanol absolut dalam jumlah tertentu seperti yang tertera pada label botol reagen dan beri tanda centang (√) pada label untuk menunjukkan penambahan etanol absolut.

C. Buffer Elusi adalah a 0.1x solusi TE mengandung sedikit EDTA. Jika EDTA mempengaruhi percobaan selanjutnya, dianjurkan untuk mengganti Elution Buffer dengan air deionisasi steril.

1. Pemrosesan Sampel:

A. Pengumpulan dan Penyimpanan Bahan

Jika bahan yang baru dikumpulkan tidak dapat langsung digunakan, masukkan ke dalam nitrogen cair untuk pendinginan dan terakhir simpan pada suhu -80°C. Bahan kering dapat disimpan pada suhu kamar.

B. Jika kondisinya memungkinkan, kumpulkan bahan-bahan segar bila memungkinkan, karena bahan segar mengandung lebih sedikit polisakarida dan polifenol.

C. Saat mengumpulkan jamur dari kultur cair, pisahkan cairan dan kumpulkan sel jamur dengan sentrifugasi.

2. Timbanglah 100 mg sampel segar atau tidak melebihi 20 mg bahan kering dan giling dengan nitrogen cair.

(Catatan: Jumlah sampel yang berbeda mungkin berbeda; disarankan untuk mengoptimalkan jumlah sampel melalui uji pra-eksperimental.)

3. Menambahkan 400μl Reagen Buffer I dan 10μl RNaseA (10 mg/ml), memastikan tidak ada gumpalan pada sampel tanah. Gumpalan sulit untuk dilisiskan, mengurangi hasil DNA. Juga, jangan di campur Reagen Buffer I dan RNaseA sebelum digunakan.

4. Inkubasi pada suhu 65°C selama 5 menit, balikkan campuran dengan lembut 2-3 waktu. Langkah ini digunakan untuk lisis sel. Jika sampel sulit untuk dilisiskan, memperpanjang waktu inkubasi, tapi tidak lebih dari itu 30 menit.

5. Menambahkan 130μl Reagen Buffer II dan aduk rata, lalu mandi es 5 menit (langkah ini digunakan untuk mengendapkan polisakarida dan protein).

6. Sentrifugasi lisat untuk 5 menit pada 14,000 rpm (20,000×g).

(Catatan: Beberapa bahan tanaman mungkin mengandung banyak zat kental pada langkah ini, yang dapat memotong DNA pada langkah selanjutnya. Karena itu, keadaan idealnya adalah menghilangkan zat-zat ini selama langkah ini. Setelah sentrifugasi, pindahkan supernatan ke tabung centrifuge baru. Jika terdapat sejumlah besar bahan flokulan dalam supernatan setelah sentrifugasi, ini menunjukkan bahwa jumlah sampel awal terlalu besar. Pertimbangkan untuk mengurangi jumlah sampel awal.)

7. Pindahkan cairan yang diperoleh dengan hati-hati ke dalam tabung centrifuge baru.

(Catatan: Sekitar 450μl cairan dapat ditransfer; untuk beberapa spesies, mungkin kurang dari 450μl.)

8. Tambahkan volume yang sama Buffer Reagen C dan etanol absolut dengan volume yang sama ke dalam lisat, lalu aduk rata.

(Misalnya: Tambahkan 450μl Reagen Buffer C, kemudian tambahkan 450μl etanol absolut. Jika volume lisat kurang dari 450μl, mengurangi jumlah Reagen Buffer C secara proporsional. Menambahkan Reagen Buffer C akan menyebabkan sedikit pengendapan, namun hal ini tidak akan memengaruhi eksperimen selanjutnya.)

9. Tambahkan cairan yang diperoleh ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan) (sekitar 650-700μl setiap kali), centrifuge lebih besar dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang sampah yang dikumpulkan, dan masukkan kembali tabung pengumpul ke dalam kolom pemurnian untuk langkah selanjutnya.

10. Ulangi langkah 9, tambahkan sisa cairan ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan), centrifuge lebih besar dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang sampah dan tabung pengumpul.

11. Tempatkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan) ke dalam tabung koleksi, menambahkan 300μl Buffer Cuci 1,centrifuge lebih besar dari 8,000 rpm untuk 1 menit, membuang limbah, dan letakkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan) kembali ke dalam tabung untuk langkah berikutnya.

(Catatan: Konfirmasikan penambahan etanol absolut pada Wash Buffer 1.)

12. Menambahkan 500μl Buffer Cuci 1 ke kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan), sentrifugasi di 14,000 rpm (20,000×g) untuk 2 menit, memperpanjang waktu sentrifugasi dengan tepat untuk memastikan membran cukup kering.

13. Tempatkan kolom pemurnian ekstraksi DNA (perlengkapan) ke dalam tabung centrifuge yang baru, biarkan terbuka, dan inkubasi pada suhu 65°C selama 2 menit. Perpanjang langkah ini sesuai kebutuhan untuk menguapkan etanol guna mencegah residu etanol memengaruhi eksperimen hilir.

14. Pipet 100μl Buffer Elusi ke membran kolom, sentrifugasi di 12,000 rpm untuk 2 menit.

(Catatan: 1. Menggunakan 50μl Elution Buffer untuk mengelusi DNA dapat meningkatkan konsentrasi DNA tetapi mengurangi hasil DNA secara keseluruhan; 2. Eluat yang mengandung DNA dapat diaplikasikan kembali ke kolom pemurnian ekstraksi DNA dan disentrifugasi pada 12,000 rpm untuk 2 menit lagi untuk meningkatkan hasil DNA.)