Proteinaza K je važna enzim koristi se u laboratorijima molekularne biologije za probavu i uklanjanje proteina iz pripravaka nukleinskih kiselina. Ovaj proteolitički enzim ima ključna svojstva koja ga čine iznimno korisnim za istraživačke primjene. U ovom postu, istražit ćemo što je točno proteinaza K, kako funkcionira, i njegove brojne upotrebe u laboratoriju.
Što je proteinaza K?
Proteinaza K je serinska proteaza širokog spektra izolirana iz gljive Tritirachium album. Može brzo probaviti proteine u manje peptidne fragmente i aminokiseline.
Ime “proteinaza K” dolazi od njegove sposobnosti probave keratina, čvrsti strukturni protein koji se nalazi u kosi, noktiju, perje, itd. Gljivica Tritirachium album luči proteinazu K kada joj je keratin jedini izvor dušika.
Koje su činjenice o proteinazi K?
Neke ključne činjenice o proteinazi K:
- Klasifikacija: Pripada obitelji peptidaza S8 (obitelj subtilisin)
- Katalitički tip: Serinska proteaza
- Optimalni pH:5 – 12.0
- Optimalna temperatura:50°C – 65°C
- Molekularna masa:28,930 I
Proteinaza K sadrži katalitičku trijadu od tri aminokiseline – aspartat, histidin, i serin. Serin djeluje kao nukleofil koji cijepa peptidne veze. Ioni kalcija važni su za punu enzimsku aktivnost.
Kako djeluje proteinaza K?
Kao serinska proteaza, proteinaza K katalizira hidrolizu peptidnih veza uz karboksilnu skupinu alifatskih i aromatskih aminokiselina.
Njegov mehanizam djelovanja sliči mehanizmu drugih serinskih proteaza poput kimotripsina i tripsina. Evo ključnih koraka:
- Katalitički serin enzima inicira nukleofilni napad na peptidnu vezu karbonilni ugljik.
- Ovo tvori tetraedarski intermedijer stabiliziran vodikovom vezom.
- Tada se veza dušik-ugljik prekida, otpuštajući prvi produkt i stvarajući acil-enzimski intermedijer.
- Molekula vode deaktivira enzim, puštanje drugog proizvoda.
- Ovo regenerira aktivno mjesto serina za još jedan krug katalize.
Proteinaza K cijepa proteine na unutarnjim peptidnim vezama kao endopeptidaza. Nema strogu specifičnost, ali preferira velike hidrofobne ostatke. To mu omogućuje brzu razgradnju većine proteina na manje fragmente.
Za što se koristi proteinaza K?
Proteinaza K postala je bitan reagens za istraživanja molekularne biologije. Ovdje su neke od njegovih najčešćih upotreba:
Probavljanje kontaminirajućih proteina
Prilikom izolacije DNA ili RNA iz stanica i tkiva, proteinaza K se koristi za probavu kontaminirajućih proteina. Time se uklanjaju nečistoće iz pripravaka nukleinskih kiselina. Dodavanje deterdženata kao SDS pomaže izložiti proteine za poboljšanu probavu.
Inaktivirajuće nukleaze
Mnoge nukleaze koje mogu razgraditi DNA i RNA same su proteini. Proteinaza K brzo deaktivira ove štetne nukleaze proteolitičkim cijepanjem. Ovo štiti izolirane nukleinske kiseline od razgradnje.
Probava tkiva
Proteinaza K može pomoći u rastavljanju stanica i solubilizaciji tkiva, otpuštanje nukleinskih kiselina za ekstrakciju. Uključen je u pufere za lizu tkiva za protokole pročišćavanja DNA/RNA.
Analiza proteina
Proteaza proizvodi specifične fragmente peptida koji daju informacije o strukturi proteina. Obrasci probave proteinaze K korisni su za proučavanje proteinskih domena, mjesta za izmjene, itd.
Inaktiviranje infektivnih priona
Kao endopeptidaza, proteinaza K može probaviti pogrešno savijene prionske proteine odgovorne za prijenosne spongiformne encefalopatije poput Creutzfeldt-Jakobove bolesti. Koristi se za inaktivaciju kontaminacije prionima.
Sekvenciranje DNA
Neke metode sekvenciranja DNA koriste proteinazu K za uklanjanje DNA polimeraze nakon produljenja sekvence, priprema DNK za elektroforezu.
Hibridizacija in situ
Enzim može nježno permeabilizirati fiksne stanice/tkivo za hibridizaciju nukleotidnih sondi uz očuvanje integriteta RNA i DNA.
Koje uvjete zahtijeva proteinaza K?
Slijede uvjeti koji su potrebni za pravilno funkcioniranje proteinaze K.
Temperatura
Proteinaza K pokazuje visoku aktivnost od 50°C do 65°C, s optimalnom temperaturom od oko 60°C. Zadržava određenu proteolitičku sposobnost čak i na 37°C. Više temperature vjerojatno čine proteinske strukture dostupnijima.
pH
Ovaj enzim djeluje u širokom pH rasponu od pH 4 na pH 12, s maksimalnom aktivnošću između pH 7.5 i 12. Najbolji su alkalni uvjeti, ali dobro djeluje i neutralni pH.
Deterdženti
Dodavanje ionskih deterdženata poput SDS-a (natrijev dodecil sulfat) može pojačati aktivnost proteinaze K denaturacijom proteinskih supstrata. Neionski deterdženti poput Triton X-100 također raditi.
Dvovalentni kationi
Proteinaza K zahtijeva ione kalcija za punu enzimsku aktivnost i stabilnost. EDTA kelatira kalcij i može inhibirati enzim. Međutim, proteinaza K još uvijek zadržava neku funkciju bez kalcija.
Kako se proteinaza K koristi u laboratoriju?
Proteinaza K ima važne funkcije u laboratoriju i koristi se u laboratoriju na sljedeće načine:
Recept pufera za proteinazu K
Tipični pufer za probavu proteinaze K sadrži:
- 10 mM Tris-HCl pH 8.0
- 100 MM NaCl
- 5% SDS
- 50 μg/mL proteinaze K
Tris održava alkalni pH od oko 8.0. NaCl daje određenu ionsku snagu. SDS denaturira proteine za probavu. Međuspremnik se po potrebi može modificirati.
Protokol probave
- Dodajte proteinazu K u pufer neposredno prije upotrebe.
- Inkubirajte uzorke u puferu za 30 min do 2 sati na 50°C do 65°C.
- Inaktivirajte proteinazu K zagrijavanjem na 95°C 10 min ili pomoću PMSF-a.
Dulje probave ili viša temperatura mogu povećati aktivnost. Kontekst uzorka diktira optimalne uvjete.
Oprez!
Proteinaza K je vrlo snažna proteaza. Mora se paziti da se izbjegne kontaminacija uzoraka ili degradacija proteina koji će se analizirati. Uvijek nosite rukavice i koristite namjenske zalihe.
Kako se proteinaza K inaktivira?
Nakon što je proteinaza K poslužila svojoj svrsi, mora se inaktivirati da bi se zaustavila daljnja probava. Evo nekoliko metoda:
- Grijanje: Temperature iznad 90°C brzo deaktiviraju enzim. Međutim, grijanje ne eliminira u potpunosti zaostalu aktivnost.
- PMSF: Ovaj ireverzibilni inhibitor serin proteaze kovalentno modificira katalitički serin, trajno blokira aktivnost.
- AEBSF: Drugi inhibitor serin proteaze koji trajno inaktivira proteinazu K.
- TCA: Trikloroctena kiselina denaturira i taloži enzim.
Grijanje je najprikladnija metoda, ali inhibitori serin proteaze osiguravaju potpunu inaktivaciju.
Koje su neke alternative proteinazi K?
Neke alternative proteinaze K uključuju:
- Pronaza: Nespecifična mješavina proteaza izolirana iz Streptomyces griseus.
- tripsin: Serinska proteaza specifična za lizin i arginin.
- Pepsin: Asparaginska proteaza iz želučanog soka sisavaca. Najbolje djeluje u kiselim uvjetima.
- Papain: Cistein proteaza iz papaje. Često se koristi za disocijaciju stanica.
Svaki ima određeno preklapanje s proteinazom K u razgradnji proteina, ali se njihova specifična svojstva razlikuju. Proteinaza K još uvijek se najčešće koristi u opće laboratorijske svrhe.
Zaključak
Snažna serin proteaza proteinaza K nezamjenjiva je za istraživanja i dijagnostiku molekularne biologije. Njegova izvanredna sposobnost da brzo probavi proteine dok ostaje aktivan u teškim uvjetima čini ga glavnim enzimom za uklanjanje kontaminirajućih proteina i zaštitu nukleinskih kiselina.
Razumijevanje što je proteinaza K, kako funkcionira, a njegovi optimalni radni uvjeti omogućuju istraživačima da iskoriste njegov puni potencijal u laboratoriju. Ova svestrana proteaza i dalje omogućuje bezbrojne tehnike eliminacijom interferirajućih proteina i deaktiviranjem štetnih nukleaza za obnavljanje DNA i RNA najveće čistoće.
