Što je PCR-SSCP? Prijave i cjeloviti vodič

S razvojem tehnika molekularne biologije, Kontinuirano su se pojavile različite metode za otkrivanje genskih struktura i mutacija. Posebno nakon pojave od PCR tehnologija, Različite tehnike otkrivanja gena u kombinaciji s PCR -om dodatno su pokrenule napredak istraživanja gena. Tehnike poput izravnog sekvenciranja asimetričnih PCR proizvoda, cijepanje ribonukleaza (R najbolje), i analiza polimorfizma duljine restrikcije (RFLP) postali su moćni alati za analizu gena. Međutim, Ove su metode relativno glomazne za rad, imaju značajna ograničenja, ili zahtijevaju visoke eksperimentalne uvjete, čineći ih neprikladnim za opće kliničke laboratorije.

Uveden u 1989, PCR-SSCP (Jednolančanski polimorfizam) prošao je kontinuirano poboljšanje i usavršavanje, čineći to jednostavnijim, brže, i osjetljivija metoda za otkrivanje mutacija gena. Ne koristi se samo za otkrivanje mutacija točaka i brisanja kratkih nizova i umetanja, već se primjenjuje i u kvantifikaciji DNK, Nadgledanje unakrsne kontaminacije u PCR dijagnostičkim eksperimentima, i istraživanje izvora infekcije. Zbog izvanrednih prednosti SSCP -a, široko se primjenjuje posljednjih godina.

Principi i karakteristike SSCP

• Otkriće i osnovni koncept:
  • Jednolančani DNK (ssDNA) Fragmenti pokazuju složene prostorne sklopive konformacije održane intramolekularnim interakcijama, prvenstveno bazno uparivanje.
  • Jedna bazna promjena može značajno ili malo izmijeniti prostornu konformaciju, što rezultira različitim uzorcima migracije u poliakrilamidnom gelu.
• Mehanizam za razdvajanje:
  • Nezadovoljni poliakrilamidni gel elektroforeza (STRANICA) mogu oštro odvojiti molekule ssDNA s različitim konformacijama zbog različitih razina opstrukcije u gelu.
• SSCP analiza:
  • Nazvan jednolančanski polimorfizam konformacije (SSCP) Japanski istraživač Orita i kolege.
  • Primijenjeno za otkrivanje genskih mutacija u PCR-amplificiranim proizvodima, Povećavanje jednostavnosti i osjetljivosti.
• Osnovni postupak:
  1. PCR amplifikacija: Pojačajte ciljani DNK.
  2. Denaturacija i renaturacija: Denatura specifični PCR proizvodi i brzo ih reneriraju kako bi tvorili jednolančane molekule DNK sa specifičnim prostornim strukturama.
  3. Stranica koja ne denagura: Izvršite elektroforezu o poliakrilamidnom gel na odgovarajućoj količini jednolančane DNK.
  4. Otkrivanje: Analizirajte rezultate pomoću radiografske autoradiografije, bojenje srebra, ili bojenje etidij bromidom.
• Tumačenje:
  • Promjena brzine migracije ssDNA u usporedbi s normalnom kontrolom ukazuje na promjenu konformacije, sugerirajući osnovnu mutaciju u tom fragmentu DNK.
• Prednosti:
  • Jednostavan, brzo, i osjetljiva metoda.
  • Ne zahtijeva specijaliziranu opremu.
  • Pogodno za kliničke laboratorije.
• Ograničenja:
  • Samo otkriva mutacije; Potrebno je daljnje sekvenciranje za utvrđivanje točnog položaja i vrste mutacije.
  • Potrebni strogi uvjeti elektroforeze.
  • Mogući lažni negativi Ako mutacije točaka ne mijenjaju značajno konformaciju ssDNA ili ako se drugi uvjeti miješaju.
• Učinkovitost otkrivanja:
  • Unatoč ograničenjima, SSCP se može pohvaliti visokom stopom otkrivanja u usporedbi s drugim metodama.
  • Sposoban identificirati nepoznate mutacije baze unutar ciljanog fragmenta DNK.
  • Takao je pokazao da SSCP može otkriti 90% mutacija jednostruke baze u fragmentima DNA kraće od 300 bps.
• Daljnje prijave:
  • SSCP može razdvojiti mutantnu ssDNA s različitim stopama migracija putem elektroforeze poliakrilamida.
  • Omogućuje daljnje pročišćavanje i identifikacija mutantnih fragmenata DNA na razini niza.

Razvoj i poboljšanja SSCP -a

• Početni razvoj:
  • U početku, SSCP je uključivao ugradnju izotopa u PCR proizvode za pojačavanje, a rezultati su prikazani kroz autoradiografiju. To je predstavljalo izazove za široko usvajanje.
• Pojednostavljenje:
  • Kombinacija bojenja DNK srebra s PCR-SSCP, posebno primjena bojenja izravnog etidija bromida, uvelike pojednostavio metodu.
• Nedavna značajna poboljšanja:
  • RNA-SSCP analiza:
    • Osnovni princip: RNA ima više zamršene sekundarne i tercijarne konformacije, što ga čini vrlo osjetljivim na mutacije s jednom bazom, na taj način povećavajući stope otkrivanja.
    • Stopa otkrivanja mutacije može premašiti 90%.
    • RNA je manje sklona formiranju dvostrukih pramena, omogućujući veću količinu koja se koristi u elektroforezi, što je korisno za bojenje etidij bromida.
    • Međutim, Ova metoda dodaje korak obrnute transkripcije i zahtijeva dulje prajmere koji sadrže sekvence promotora RNA polimeraze, Sve veća složenost.
• Kombinacija SSCP -a s drugim metodama otkrivanja mutacije:
  • Heterodupleksna analiza (To):
    • Značajno poboljšava stope otkrivanja u kombinaciji sa SSCP -om.
    • Uključuje hibridizaciju sonde s ciljanom ssDNA ili RNA. Hibridni pramenovi koji sadrže neusklađeni bazni par mogu se odvojiti od potpuno komplementarnih hibridnih pramenova putem elektroforeze u ne-denaturiranju PAG gela.
    • Izvođenje i SSCP i HET analize istog ciljanog niza može se postići blizu 100% Stopa detekcije za točke mutacije, uz održavanje eksperimentalne jednostavnosti.

Postupak PCR-SSCP

Priprema gela na temelju duljine fragmenta DNK

Za fragmente DNK kraći od 1kb, Odaberite koncentraciju poliakrilamidnog gela na sljedeći način:

• Dužina fragmenta DNK (bps): % Koncentracija akrilamida
  • 1KB -700B: 3.5%
  • 700b -500b: 5%
  • 500B-200b: 8%
  • 200b: 12%

Prepreze prije SCP-a

• PCR amplifikacija: Pojačajte određeni proizvod s minimalnim razmazom (Potvrđena elektroforezom agaroznog gela).

1. Priprema poliakrilamidnog gela (Pal)

• Pripremite otopinu gela na temelju potrebne koncentracije iz gornje tablice.
• Umetnite češalj u gel kalup.
• Ulijte otopinu gela s jednog kraja češlja, Naginjanje kalupa prema kraju izlijevanja dok gel dopire do zuba češalja kako bi se spriječilo stvaranje mjehurića.
• Neka se gel očvrsne na sobnoj temperaturi za 1 sat.
• Uklonite češalj i na vrh gela dodajte 1 × tbe međuspremnik.

2. Elektroforeza

1. uzeti 10 μl PCR proizvoda.
2. Dodati 10 μl agensa (95% formamid, 10 MMOL/L EDTA, 0.02% bromofenol plavi).
3. Dodati 30 μl mineralnog ulja.
4. Prokuhati 5 minuta, Zatim odmah stavite u ledenu kupelji 2 minuta.
5. Umetnite cijelu vodenu fazu na gel.
6. Izvršite elektroforezu na 10-15 ° C:
   • Započnite s 300V za 5 minuta.
   • Nastavite s 120V za 8 sati.
7. Nakon elektroforeze, Zaustanite gel u međuspremniku od 1 × tbe 0.5 μg/ml Etidium bromid za 30-45 minuta.
8. Promatrajte pod UV svjetlom ili nastavite do bojenja srebra.

3. Bojenje srebra

1. Dvaput operite Pag deioniziranom vodom.
2. Popraviti gel u otopini 10% etanol i 0.5% octena kiselina za 6 minuta.
3. Dvaput operite deioniziranom vodom.
4. Uroniti 0.2% srebrni nitrat (Agno3) Rješenje za 10 minuta.
5. Pranje 3-5 puta s deioniziranom vodom.
6. Razviti se u rješenju 1.5% natrijev hidroksid (Naoh) i 0.4% formaldehid za 7 minuta.
7. Zaustavite razvoj s 0.75% natrijev karbonat (NACO3).

Primjene SSCP -a

Budući da su Orita i kolege koristili SSCP za analizu polimorfizma ljudske DNK, Metoda se opsežno koristi u raznim poljima, uključujući otkrivanje genskih mutacija povezanih s rakom i nasljednim bolestima, kao i kod tipkanja virusa i nadgledanja kontaminacije.

Otkrivanje mutacije gena raka

• Mutacije povezane s tumorom:
  • SSCP se široko koristi za otkrivanje mutacija u genima koji se odnose na različite karcinome kao što je astrocitoma, tumori na mozgu, Mali stanični rak pluća, rak želuca, i kolorektalni rak.
  • Primijenjena je za otkrivanje mutacija u p53 genu u tim tumorima i mutacijama ras gena u raku pluća.
• Uspješne aplikacije:
  • Nedavno, Sugano i sur.. Uspješno upotrijebljeni SSCP obojeni srebrom za otkrivanje mutacije na položaju 12 gena c-ki-ras2, dovršavajući postupak elektroforeze i bojenja unutar 2.5 sati.

Istraživanje nasljednih bolesti

• SSCP se koristi u proučavanju gena uključenih u nasljedne bolesti poput:
  • Cistična fibroza: Otkrivanje mutacija u CFTR genu.
  • Neurofibromatoza 1: Analiza genskih mutacija.
  • Obiteljska adenomatozna polipoza: Istraživanje gena vezano za ovo stanje.
• RNA-SSCP vs. DNK-SSCP:
  • Sharkar i dr.. koristio RNA-SSCP za otkrivanje genskih sekvenci u 28 hemofilija b bolesnika.
  • Usporedba s DNK-SSCP i otkrivenom sekvenciranjem gena 20 osnovne mutacije u genu od 2,6kb faktora IX, s RNA-SSCP otkrivanjem 70% od tih mutacija u usporedbi s 35% Otkriveno DNK-SSCP, Pokazujući veću osjetljivost RNA-SSCP.

Tipiranje virusa i nadzor kontaminacije

• Tipiranje virusa:
  • SSCP se koristi za tipkanje virusa i praćenje onečišćenja u PCR eksperimentima.
  • YAP je koristio ugniježđenu PCR za otkrivanje HBV uzoraka iz različitih regija, nakon čega slijedi SSCP analiza, koji su otkrili različite SSCP uzorke za svaki uzorak, što ukazuje na regionalne varijacije u HBV DNK i uklanjanje mogućnosti unakrsne kontaminacije.
• Nadgledanje kontaminacije:
  • SSCP služi kao pouzdana metoda kako bi se osigurala točnost PCR dijagnostičkih rezultata.

Studije prijenosa patogena

• SSCP se koristi za proučavanje prijenosnih ruta patogena.

Kvantitativna analiza DNK

• Analiza stanica raka dojke:
  • SSCP, u kombinaciji s konkurentnim PCR -om, korišten je za kvantitativnu analizu mutantnih p53 gena u stanicama karcinoma dojke.
  • Prednost metode leži u korištenju unutarnjih standarda koji se razlikuju od ciljanog DNK za samo jednu bazu, Osiguravanje identičnih uvjeta pojačanja, a time i preciznije kvantifikacije DNK.

Mjere opreza za SSCP

SSCP je brz, jednostavan, i osjetljiva metoda za otkrivanje genskih mutacija. Da bi se postigli optimalni rezultati, Treba primijetiti sljedeće mjere opreza:

Ponovljivost:

• Glavni čimbenici koji utječu na ponovljivost SSCP -a su napon i temperatura elektroforeze. Održavanje ovih uvjeta osigurava dobru ponovljivost SSCP uzoraka.
• Općenito, SSCP uzorci prikazuju dva jednolančana DNK pojasa, Ali ponekad se može pojaviti samo jedan ili više od tri pojasa zbog sličnih prostora između dvije jednolančane molekule DNK. Prisutnost više od tri pojasa može ukazivati ​​na mješavinu divljih i mutiranih fragmenata DNK.

Utjecaj duljine ciljane DNK sekvence:

• SSCP je učinkovitiji u otkrivanju mutacija točaka u kraćim DNK ili RNA nizovima nego u duljim. To bi moglo biti zato što promjene u jednoj bazi u dužim molekulama imaju manji utjecaj na održavanje prostorne konformacije.
• Neki istraživači vjeruju da je za lance DNK kraći od 400 bps, Duljina ne utječe na učinkovitost SSCP -a. Pažljiv odabir eksperimentalnih uvjeta može postići brzinu otkrivanja 90% za točke mutacije u 354 BP DNK fragmenti.

Napon i temperatura elektroforeze:

• Za održavanje stabilnih prostornih konformacija jednolančane DNK, SSCP treba provesti na nižim temperaturama (obično između 4 ° C i 15 ° C). Visoki napon na startu (250V) za 5 minuta pomaže u početku odvojiti jednolančanu DNK s različitim konformacijama bez značajnog povećanja temperature gela. Nakon toga treba slijediti niži napon (Oko 100V) Da biste dodatno razdvojili pramenove.
• Točan napon za elektroforezu treba odrediti na temelju specifičnih eksperimentalnih uvjeta.

Utjecaj položaja mutacije točke:

• Položaj točke mutacije u DNK ili RNA utječe na stope otkrivanja SSCP na temelju njegove uloge u održavanju prostorne konformacije, a ne njegov linearni položaj na lancu.
• Mutacije u središnjoj regiji DNK općenito je lakše otkriti u usporedbi s onima u blizini krajeva.
• Međutim, Čak i mutacije u središnjoj regiji mogu biti neotkrivene ako ne mijenjaju značajno prostornu konformaciju. Na primjer, Whiteova studija otkrila je to samo 2 od 9 Otkriveni su uzorci s točkastim mutacijama u petlji konstrukcije dlake, što ukazuje na brzinu otkrivanja 22%.

Tumačenje SSCP rezultata:

• SSCP razdvaja jednolančanu DNK na temelju prostorne konformacije, a ne molekularne mase ili naboja. Ponekad, Stope migracije normalnih i mutantnih lanaca su vrlo blizu, što je teško razlikovati između njih.
• Tipično, Dužine elektroforeze 16-18 CM su potrebni za precizno određivanje rezultata na temelju ograničenja otkrivanja, koja je najmanja vidljiva razlika u udaljenosti elektroforeze između mutantnih i normalnih fragmenata DNK.
• Ako je udaljenost veća od ograničenja otkrivanja (Npr., 3mm), Naznačena je mutacija. Manja udaljenost sugerira nikakvu promjenu. Postavljanje niskog ograničenja otkrivanja može dovesti do lažnih pozitivnih rezultata.
• Ostali uvjeti, kao što je količina PCR proizvoda, stupanj križanja PAG -a, i koncentracija gela, treba odabrati na temelju određenih eksperimentalnih zahtjeva.

Pojedinosti PCR-SSCP-a prema koracima

Priprema uzorka

1. PCR pojačanje i otkrivanje:
   • Izvršite PCR pojačanje pomoću odgovarajućih prajmera i odaberite odgovarajuću temperaturu žarenja.
   • Otkrijte proizvode za pojačavanje tako što ćete ih pokrenuti na a 2-2.5% Agarozni gel kroz horizontalnu elektroforezu. Opterećenje 3-5 µl PCR proizvoda.
   • Optimalna koncentracija PCR proizvoda trebala bi biti oko 10 ng/µl.
2. Miješanje PCR proizvoda s denaturacijskim međuspremnikom:
   • Dodati 5 µL SSCP pufera uzorka (denaturni međuspremnik, Isto kao i međuspremnik za sekvenciranje u “Molekularno kloniranje”) do dna čiste PCR cijevi.
   • Dodajte PCR proizvod pojačanja u sredinu međuspremnika. Prilagodite iznos na temelju vidljivosti pojasa na agaroznom gelu:
     • Ako je bend svijetao, dodati 1 µl.
     • Ako je rezultat izvrstan, dodati 0.5 µl.
     • Ako bend nije baš jasan, dodati 1.5, 2, ili 3 µl u skladu s tim.
   • Povećati količinu pufera uzorka proporcionalno, Npr., za 3 µl PCR proizvoda, dodati 8 µl pufera za bolju denaturaciju.
3. Denaturacija PCR proizvoda:
   • Centrifugirati cijev da koncentrira uzorak na dnu.
   • Denatura uzorak na 95 ° C za 10 minuta koristeći a PCR stroj, zatim odmah stavite PCR proizvod na led za 5 minuta da se spriječi renaturacija.

   Bilješka: Koraci 3 i 4 može se izvesti nakon četvrtog koraka pripreme gela dok čeka da se gel učvrsti.

Priprema gela

1. Priprema staklenih ploča:
   • Isperite svaki par staklenih ploča s vodom iz slavine, a zatim DDH2O.
   • Osušite staklene ploče upijajućim papirom, a zatim obrišite bezvodnom etanolom.
   • Dopustiti da etanol ispari za 2-3 minuta.
   • Sastavite staklene ploče i stavite ih u postolje za lijevanje gela, Osiguravanje i strana i dna su osigurani.
   • Zategnite vijke za montažu kako biste održali razinu ploča. (Provjerite ima li curenja pomoću bezvodnog etanola.)

Veliki gelovi (50% Koncentracija glicerola)

Mali gelovi (50% Koncentracija glicerola)

Gel izlijevanje

1. Miješanje gela: Nakon pripreme otopine gela prema navedenoj formulaciji, Temeljito pomiješajte kako biste osigurali uniformnost.
2. Ulijevanje u staklene ploče: Pažljivo izlijte pripremljenu otopinu gela u okupljene staklene ploče. Osigurajte da nijedan mjehurići zraka nisu zarobljeni tijekom postupka izlijevanja. Ako se primijete bilo koji mjehurići, Nježno nagnite ploče kako bi se mjehurići digli na površinu. Lagano dodirivanje strana ploča može pomoći u oslobađanju zarobljenih mjehurića zraka.
3. Umetanje češlja: Jednom kada razina otopine gela dosegne otprilike 0,5 cm ispod gornjeg ruba staklenih ploča, Umetnite češalj u gel. Osigurajte da ne postoje mjehurići zraka zarobljeni između zuba češljanja i površine gela. Ako su prisutni bilo koji mjehurići, Uklonite češalj, Otpustite mjehuriće, i pažljivo ponovno umetnuti češalj.
4. Dopuštajući polimerizaciju gela: Nakon umetanja češlja, Dopustite da se gel polimerizira postavljanjem ploča ili ravno ili pod laganim kutom (manje nego 10 stupnjevi) na razini površine za približno 30 minuta. Za to vrijeme, gel će se polimerizirati i učvrstiti.

Bilješka: Ovo je ujedno i prikladno vrijeme za nastavak denaturacije PCR uzoraka kako je opisano u koracima 3 i 4 prvog odjeljka.

Opterećenje gela

• Postavljanje gela:
  • Izvadite češalj s gela odmah nakon polimerizacije.
  • Osigurati da se primjenjuje čak i sila za održavanje integriteta bušotina.
  • Pričvrstite gel ploču na aparat za elektroforezu tako da se prema unutarnje strane okrene prema unutra.
  • Polako pređite ploču gel na pufer elektroforeze kako biste izbjegli velike mjehuriće zraka.
• Pred-elektroforeza:
  • Dodajte 1 × tbe pufer elektroforeze u gornji rezervoar dok razina tekućine ne bude oko 1 cm iznad kraćeg ruba staklene ploče.
  • Osigurajte da nema curenja iz gornjeg rezervoara.
  • Postavite napon na 140-150V za veliki aparat i 110-120V za mali aparat.
  • Pred-elektroforeza za približno 10 minuta.
• Umetanje uzorka:
  • Uzastopno dodajte pripremljene uzorke u jažice gela pomoću mikrosiringe.
  • Izbjegavajte učitavanje uzoraka u dvije bušotine najbliže rubovima svake gel ploče.
• Elektroforeza:
  • Postavite napon na 140-150V za veliki aparat i 110-120V za mali aparat.
  • Izvršite elektroforezu na temperaturi od 10-15 ° C za najmanje 10 sati.

Bojenje

• Fiksacija:
  • Uklonite gel iz uređaja, Označite polazište, i uroniti u 70% etanol za 15 minuta na shakeru.
  • Oporavite etanol nakon fiksacije i dva puta isperite destiliranom vodom za oko 3 Zapisnici po ispiranju.
• Bojenje:
  • Zaustanite gel u otopini za bojenje (200ML koji sadrži 3.6% NaOH 4,2 ml, 20% Agno3 3.6ml, amonijak 2ml) za 30 minuta.
  • Prilagodite vrijeme bojenja ako istovremeno oboje dva gela.
• Razvijanje:
  • Razviti gel u razvoju rješenja (200ML koji sadrži 1% natrijev citrat 1ml, formaldehid 100UL) Sve dok bendovi nisu jasno vidljivi.
  • Isperite tri puta destiliranom vodom za 3 minute da zaustave razvoj.
  • Alternativno, Osjenite gel uranjajući ga u pufer od 1 × tbe koji sadrži 0,5Ug/ml etidij bromida za 10 minute i vizualizirajte pod ultraljubičastom svjetlošću

Formule

10× tbe formula:

• Tris baza: 108g
• Borna kiselina: 55g
• 0.5mol/l edta (pH 8.0), volumen podešen na 1L

Denaturna formula pufera:

• 98% Deionizirani formamid
• 10MMOL/L EDTA (pH 8.0)
• 0.025% Ksilen cijanol ff
• 0.025% Bromofenol plavi

Bilješke:

1. Obnovljivost:
   • Održavanje stabilnog napona i temperature tijekom elektroforeze glavni je faktor koji utječe na obnovljivost SSCP -a.
   • Tipično, SSCP uzorci prikazuju dva jednolančana DNK pojasa, Ali ponekad se može pojaviti samo jedan ili tri ili više bendova, moguće zbog prisutnosti sličnih trodimenzionalnih konformacija između divljeg tipa i mutantnih fragmenata DNA.
2. Utjecaj duljine ciljane DNK sekvence:
   • SSCP ima veću stopu otkrivanja za točke mutacije u DNK ili RNA kratkog lanca u usporedbi s DNK dugog lanca. To je vjerojatno zato što pojedinačne promjene u bazi u molekulama DNA i RNA dugotrajne imaju manji utjecaj na održavanje trodimenzionalnih konformacija.
   • U slučaju kraćih lanaca DNK (Ispod 400bp), Duljina DNK ne utječe na učinkovitost SSCP -a.
3. Učinci napona i temperature elektroforeze:
   • Za održavanje stabilne trodimenzionalne konformacije jednolančane DNK, SSCP treba izvesti na nižoj temperaturi (općenito između 4 ° C i 15 ° C).
   • Tijekom elektroforeze, Prekomjerni napon može uzrokovati povećanje temperature. Stoga, Prilikom izvođenja SSCP -a u elektroforezijskom spremniku bez uređaja za hlađenje, veći napon (250V) treba koristiti u početku, nakon čega slijedi smanjenje na oko 100 V za elektroforezu.
4. Tumačenje rezultata SSCP -a:
   • U SSCP analizi, Odvajanje jednolančanih fragmenata DNK temelji se na veličini njihove sterične prepreke, a ne molekularne mase, na taj način nije u mogućnosti odražavati molekulsku masu.
   • Tumačenje rezultata treba temeljiti na ograničenju otkrivanja, koja se odnosi na minimalnu razliku u elektroforetskoj udaljenosti između mutantnih i normalnih fragmenata DNK koji se mogu razlikovati.
5. Ostala razmatranja:
   • Uvjeti kao što je količina PCR proizvoda, gustoća umrežavanja poliakrilamidnog gela, a koncentraciju gela treba odabrati i odrediti na temelju specifičnih eksperimentalnih uvjeta.