Spektrofotometar je važan analitički instrument koji se nalazi u mnogim kemijskim i biološkim laboratorijima. Ovaj svestrani alat mjeri interakciju između svjetlosti i materije, pružanje vrijednih kvantitativnih informacija o uzorcima. Ali što točno radi spektrofotometar?? Kako radi? I za što ga možete koristiti? Ovaj će vodič objasniti ključna načela iza spektrofotometrije i kako pravilno koristiti te uređaje.
Što je spektrofotometar?
Spektrofotometar je optički instrument dizajniran za mjerenje transmisije ili apsorpcije svjetlosti koja prolazi kroz uzorak. Može odrediti koliko svjetlosti apsorbira kemijska otopina na različitim rasponima valnih duljina.
Ključne komponente osnovnog spektrofotometra su:
- Izvor svjetlosti: Generira svjetlosnu zraku primijenjenu na uzorak. Uobičajeni izvori uključuju volfram-halogen, deuterijum, xenon svjetiljke, i LED diode.
- Monokromator: Sadrži prizmu ili difrakcijsku rešetku koja razdvaja polikromatsku svjetlost na različite valne duljine.
- Selektor valne duljine: Filtrira svjetlost da prenosi samo uski pojas valnih duljina.
- Odjeljak za uzorke: Sadrži kivetu koja sadrži tekućinu uzorka.
- Detektor: Mjeri intenzitet svjetlosti koja prolazi kroz uzorak. Fotodiode, fotomultiplikarske cijevi, a fotootpornici su tipični detektori.
- Prikaz: Prikazuje podatke o apsorpciji, često u postotku prijenosa ili jedinicama apsorbancije.
Spektrofotometri omogućuju kvantitativnu analizu uzoraka na temelju njihove interakcije sa svjetlom. Oni mogu identificirati tvari, odrediti koncentracije, te procijeniti svojstva uzorka.
Što mjeri spektrofotometar?
Spektrofotometri omogućuju dva glavna mjerenja:
Prijenos
Ovo je količina svjetlosti koja prolazi kroz uzorak, izraženo u postotku. Ako uzorak prenosi 80% svjetla, ima prijenos od 80%. Prijenos ovisi o valnoj duljini.
Veća propusnost znači da više svjetlosti prolazi. Transparentna rješenja obično imaju visoku propusnost. Uzorci koji apsorbiraju neprozirno propuštaju manje svjetla i imaju manju propusnost.
Apsorpcija
Apsorpcija mjeri koliko svjetlosti apsorbira uzorak. Temelji se na propusnosti pomoću jednadžbe:
A = -log T
Gdje je A apsorbancija, a T transmisija. Apsorbancija nema jedinice. Tekućine koje jako apsorbiraju svjetlost imaju visoke vrijednosti apsorbancije. Uzorci sa slabom apsorpcijom daju niska očitanja apsorbancije.
Mjerenjem kako prijenos i apsorbancija variraju s različitim valnim duljinama, spektrofotometar proizvodi apsorpcijski spektar za uzorak. Ovaj spektar djeluje poput molekularnog otiska prsta za identifikaciju analita.
Kako djeluje spektrofotometar?
Spektrofotometri rade na principu da različite tvari različito apsorbiraju i propuštaju svjetlost na različitim valnim duljinama. Ovdje je pregled procesa mjerenja:
1. Generiraj svjetlo
Izvor svjetlosti emitira širok spektar svjetla. Uobičajeni optički izvori uključuju žarulje sa žarnom niti za vidljivo i blisko infracrveno svjetlo ili deuterijske lučne svjetiljke za ultraljubičaste valne duljine.
2. Odaberite Valnu duljinu
Monokromator odabire uski pojas valnih duljina kroz koji prolazi. Uobičajeni monokromatori imaju prizme ili difrakcijske rešetke za raspršivanje svjetlosti.
3. Propustite svjetlo kroz uzorak
Snop monokromatske svjetlosti prenosi se kroz uzorak koji se nalazi u prozirnoj kvarcnoj kiveti. Uzorak apsorbira dio energije.
4. Otkrij propuštenu svjetlost
Fotodetektor mjeri koliko svjetlosti prolazi kroz uzorak. Fotodiode i fotomultiplikatorske cijevi tipični su detektori.
5. Izmjerite apsorpciju
Omjer intenziteta propuštenog i upadnog svjetla daje postotak prijenosa. To se pretvara u vrijednost apsorbancije i prikazuje.
6. Skeniraj valne duljine
Koraci 2-5 automatski se ponavljaju u nizu valnih duljina kako bi se proizveo apsorpcijski spektar.
Mjerenjem apsorbancije na različitim valnim duljinama, sastav, koncentracija, i mogu se odrediti svojstva uzorka.
Za što se koristi spektrofotometrija?
Spektrofotometrija je postala bitna analitička tehnika koja se koristi u mnogim područjima:
- Kemija: Identificiranje spojeva, kvantificiranje analita, ocjenjivanje reakcija
- Biokemija: Protein, enzim, te DNA testovi i analize
- Mikrobiologija: Mjerenja gustoće stanica, studije rasta
- Industrija: Kontrola kvalitete, praćenje procesa proizvodnje
- Lijek: Klinička kemija, dijagnostički testovi
Neke uobičajene primjene spektrofotometara uključuju:
- Mjerenje koncentracije otopine Beerovim zakonom
- Ocjenjivanje čistoće lijekova
- Analiza hrane i pića
- Praćenje industrijskih procesa
- Određivanje kemijske kinetike
- Kvantificiranje DNA i proteina
- Identificiranje patogena i toksina
- Klinički dijagnostički testovi
Spektrofotometrija omogućuje brzo, pristupačne, i osjetljiva kvantitativna analiza uzoraka u različitim područjima.
Kako koristiti spektrofotometar
Pravilna uporaba spektrofotometra ključna je za točne rezultate. Evo nekoliko ključnih smjernica za korištenje spektrofotometara:
Pripremite uzorke
- Provjerite jesu li uzorci potpuno otopljeni i homogeni. Filtrirajte ili centrifugirajte kako biste uklonili sve čestice.
- Koristite kvarcne kivete, odgovara navedenoj duljini puta svjetlosti. Temeljito očistite i pažljivo rukujte.
- Pripremite slijepu probu koja sadrži samo otapalo za referencu. Ispravite nulu ili osnovnu crtu koristeći prazninu.
Odaberite Valne duljine
- Odaberite valne duljine na kojima uzorak apsorbira svjetlost za detekciju. Skenirajte cijeli raspon kako biste identificirali maksimalne apsorpcijske vrhove.
- Izbjegavajte područja u kojima uzorak ne apsorbira za mjerenja. Ovo rasipa svjetlosnu energiju.
Slijedite procedure
- Pročitajte i slijedite sve upute za instrument. Spektrofotometri su različitih proizvođača, modeli, softver, i pribor.
- Razvijte i potvrdite detaljne standardne operativne postupke za ponovljive rezultate.
Analizirajte podatke
- Osigurajte ispravnu kalibraciju pomoću referentnih standarda. Izradite kalibracijske krivulje ako je potrebno.
- Usrednjite višestruka mjerenja za točnost. Koristite statističku analizu za određivanje točnosti.
- Ispravite bilo kakve pozadinske smetnje od otapala ili kiveta.
Uz obuku i iskustvo, istraživači mogu u potpunosti iskoristiti spektrofotometre za pouzdanu kvantitativnu analizu uzorka.
Vrste spektrofotometara
Postoji nekoliko različitih vrsta spektrofotometara koji se koriste u laboratorijima:
UV-vidljivi spektrofotometri
- Izmjerite apsorpciju svjetlosti u ultraljubičastom i vidljivom rasponu (~200-800 nm)
- Koristite volframove halogene žarulje, deuterijske svjetiljke, ili LED kao izvori svjetlosti
- Analizirati komplekse prijelaznih metala, biološki uzorci, i vidljive boje
Infracrveni spektrofotometri
- Radite u području infracrvenih valnih duljina (~750 nm – 300 µm)
- Upotrijebite izvore infracrvenog zračenja poput Nernstovog žarulje
- Identificirati funkcionalne skupine i analizirati strukturu spojeva
Atomski apsorpcijski spektrofotometri
- Izmjerite apsorpciju svjetlosti isparenih elemenata
- Zahtijeva raspršivač s plamenom ili grafitnom peći
- Odrediti metale i metaloide u uzorcima
Fluorescencijski spektrofotometri
- Izmjerite intenzitet emitirane fluorescentne svjetlosti iz uzoraka
- Upotrijebite ksenonsku svjetiljku ili LED da osigurate pobudno svjetlo
- Analizirajte uzorke prirodnom ili induciranom fluorescencijom
Raman spektrofotometri
- Otkrijte Ramanovo raspršeno svjetlo od laserske ekscitacije
- Osigurati vibracijske i rotacijske načine molekula
- Identificirajte uzorke i kvantificirajte analite
Odabir pravog spektrofotometra ovisi o području vaše valne duljine od interesa i vrsti uzoraka koji se mjere.
Zaključak
Spektrofotometri su postali nezamjenjivi analitički instrumenti u mnogim područjima. Kvantificiranjem interakcije svjetlosti s uzorcima, brzo i osjetljivo pružaju neprocjenjive podatke o sastavu i svojstvima.
Razumijevanje što spektrofotometri mjere, kako rade, a pravilne tehnike korištenja omogućuju istraživačima da iskoriste svoj puni potencijal. Uz stalni napredak u tehnologiji detektora, izvora svjetlosti, i analiza podataka, spektrofotometri će nastaviti pokretati znanstvena otkrića u budućnosti.
