L'extraction d'acide nucléique est une technique fondamentale en biologie moléculaire et en recherche en génétique. L’isolement de l’ADN et de l’ARN d’échantillons biologiques fournit le matériel de départ pour étudier l’expression des gènes, détecter des agents pathogènes, analyser les mutations, et bien plus encore. Cependant, des différences importantes entre la structure et la stabilité de l'ADN et de l'ARN nécessitent des protocoles d'extraction spécialisés optimisés pour chaque type d'acide nucléique.
Pourquoi faisons-nous Extraire l'ARN?
L'ARN joue de nombreux rôles importants dans les cellules. Les principales raisons pour lesquelles nous extrayons l’ARN sont:
- Pour étudier l’expression des gènes – La quantité d'ARN produite par différents gènes donne un aperçu des activités cellulaires. Analyser les niveaux d'ARN par quantitatif RAP ou le séquençage de l'ARN nous permet de comprendre les processus de développement et la façon dont les cellules réagissent aux conditions changeantes.
- Pour effectuer une RT-PCR – L'extraction de l'ARN permet de le convertir en ADNc par transcription inverse. L'ADNc peut ensuite être utilisé comme modèle pour l'amplification et l'analyse PCR..
- Pour la détection virale – La présence d'ARN viral indique une infection virale active. L'extraction de l'ARN d'échantillons de patients permet le diagnostic de virus à ARN comme la grippe, coronavirus, et rétrovirus.
- Expériences de silençage génétique – L’introduction de siARN ou de miARN synthétisés artificiellement dans les cellules peut dégrader les ARNm cibles, supprimer des gènes spécifiques. Extraction d'ARN vérifie le renversement.
- Études sur la structure et la fonction de l'ARN – L’extraction de l’ARN intact est nécessaire pour étudier le repliement de l’ARN, modification, interaction, et activités enzymatiques.
- Profilage de l'expression génétique – L’ensemble de tous les ARN d’une cellule constitue son transcriptome. L'analyse du transcriptome fournit un aperçu de la régulation globale des gènes.
Les principales différences entre l'ARN et l'ADN affectent l'extraction
Bien que les deux soient des acides nucléiques, L'ARN et l'ADN présentent des distinctions importantes qui nécessitent des différences dans leur méthodologie d'extraction:
1. L'ARN est chimiquement moins stable que l'ADN
- Le sucre ribose dans l'ARN contient un groupe hydroxyle (-OH) joint au 2′ position. Cela rend le squelette phosphodiester plus sujet à l’hydrolyse spontanée..
- L'ARN est également facilement dégradé par la ribonucléase (RNase) enzymes. Les RNases sont stables et difficiles à dénaturer, et de très petites quantités fragmentent rapidement l'ARN.
- En revanche, L'ADN manque du 2′ groupe hydroxyle et n’est pas ciblé par les RNases. Cela rend l’ADN plus stable chimiquement que l’ARN.
2. Le pH optimal pour l’extraction diffère
- L'ADN est plus stable lors de l'extraction à un pH neutre ou légèrement alcalin de 7-8.
- Cependant, un pH supérieur 7 favorise l'hydrolyse alcaline de l'ARN grâce au ribose 2′-OH. Conditions acides inférieures au pH 5 sont nécessaires pour l'ARN.
- Cette différence de pH optimal présente un défi majeur lors de l’extraction simultanée des deux.
3. Abondance cellulaire et exigences en matière d'échantillons
- De nombreuses copies de l’ADN génomique sont présentes dans chaque cellule, permettant d'isoler facilement des quantités de microgrammes.
- Le pool de différents types d’ARN extraits dépend des niveaux d’expression spécifiques aux tissus. Les quantités de nanogrammes sont généralement obtenues.
- Ainsi, L’ARN nécessite une manipulation et une optimisation plus prudentes pour extraire intactes les infimes quantités présentes.
Comparaison étape par étape des protocoles d'extraction d'ARN et d'ADN
En gardant ces différences clés à l'esprit, examinons les approches spécialisées adoptées à chaque étape de l’extraction de l’ARN et de l’ADN:
1. Perturbation et homogénéisation des échantillons
- Pour l'ADN et l'ARN, la lyse cellulaire est d'abord nécessaire pour perturber les membranes et libérer les acides nucléiques. Les méthodes incluent la perturbation physique par broyage d'échantillons de tissus congelés.
- Cependant, Les inhibiteurs de RNase doivent être ajoutés immédiatement aux échantillons d'ARN au cours de cette étape pour inactiver les abondantes ribonucléases libérées.. Aucun inhibiteur n’est utilisé pour l’ADN.
2. Séparation des acides nucléiques des composants cellulaires
- Pour l'extraction d'ADN, l'ajout de solutions salines concentrées provoque la précipitation des protéines tout en laissant l'ADN solubilisé.
- Pour l'ARN, sels chaotropiques comme concentrés isothiocyanate de guanidinium dénaturer rapidement les protéines tout en inactivant les RNases.
- L'extraction organique au phénol et au chloroforme aide à séparer les acides nucléiques libérés des protéines, lipides, et des glucides pour l'ADN et l'ARN.
3. Précipitation et récupération des acides nucléiques
- La précipitation à l'éthanol ou à l'isopropanol isole l'ADN ou l'ARN des solutions aqueuses. Des conditions légèrement salées améliorent l’efficacité de la précipitation de l’ARN.
- En raison des quantités infimes d’ARN, des coprécipitants comme le glycogène ou l'acrylamide linéaire sont utilisés pour agglomérer visuellement l'ARN.
- L'ADN de haut poids moléculaire précipite facilement tandis que l'ARN reste solubilisé dans l'éthanol dans des conditions tampons spécifiques.. Cela permet leur séparation.
4. Élimination des contaminants
- Les préparations d'ADN sont traitées avec la RNase pour éliminer les fragments d'ARN co-purifiés.
- De même, La digestion par la DNase sans RNase élimine les traces d'ADN des extraits d'ARN.
- Une purification plus poussée peut être effectuée à l'aide de colonnes de centrifugation, extractions de phénol, ou des étapes de précipitation pour éliminer les sels, enzymes, glucides, et autres polluants.
Évaluation de la quantité, Pureté, et intégrité
Un contrôle qualité rigoureux est nécessaire pour garantir que l’ADN et l’ARN extraits conviennent aux techniques analytiques sensibles:
Quantification des niveaux d'acide nucléique
- Absorption des UV à 260 nm à l'aide d'un spectrophotomètre estime la concentration via la loi de Beer-Lambert.
- Quantification fluorométrique à l'aide de colorants comme SYBR Le vert I est plus sensible et plus précis que l'absorbance UV.
Évaluation de la pureté
- Le rapport A260/A280 détecte la contamination par des protéines ou du phénol. Les ratios ADN/ARN purs sont d’environ 1.8.
- Des rapports de longueur d'onde supplémentaires comme A260/A230 peuvent détecter une contamination polysaccharidique ou chaotropique.
Évaluation de l'intégrité de l'ARN
- L'électrophorèse révèle si l'ARN est intact ou dégradé. Les bandes d'ARN ribosomal pointues 28S et 18S représentent l'ARN intact.
- Le numéro d’intégrité de l’ARN (NIR) l'algorithme évalue objectivement la qualité de l'ARN à partir des électrophérogrammes.
- L'ARN dégradé apparaît sous forme de frottis plutôt que de bandes discrètes et ne convient pas aux tests en aval.
Conclusion
Bien que les extractions d'ADN et d'ARN partagent certains principes communs, L'ARN est plus sujet à la dégradation et nécessite des étapes spécifiques pour l'isoler intact. Comprendre ces différences clés permet aux chercheurs d’obtenir des acides nucléiques de haute qualité pour des applications sensibles en aval. Avec pratique, les protocoles d'extraction peuvent être affinés pour un ARN et un Purification de l'ADN provenant de diverses sources biologiques.
FAQ
Pourquoi un inhibiteur de RNase est-il nécessaire?
Les RNases dégradent rapidement l’ARN lors de l’extraction. Les inhibiteurs de RNase se lient et inactivent de manière irréversible ces enzymes, préserver l'ARN intact.
Quels sont les meilleurs tissus pour extraire l’ARN?
L'ARN est abondant dans les tissus métaboliquement actifs comme le foie, rognons, ou cellules en division active. Ceux-ci fournissent des rendements élevés. Les tissus avec des niveaux élevés de RNase comme le pancréas ou la peau sont plus difficiles.
Combien de temps l’ARN peut-il être stocké après extraction?
L'ARN isolé doit être conservé à -80°C dans de l'eau sans nucléases. Dans des conditions idéales, L'ARN peut rester intact pendant un an, mais une certaine dégradation se produit encore avec le temps.
Le choix du kit d’extraction fait-il une différence?
Oui, les composants du kit tels que les tampons de lyse et les inhibiteurs de RNase affectent la qualité de l'ARN. Certains kits fonctionnent mieux pour des applications spécifiques comme la qPCR ou le séquençage d'ARN.
