La electroforesis de ADN es una técnica de laboratorio común que se utiliza para separar fragmentos de ADN por tamaño.. Permite a los investigadores visualizar, identificar, y purificar muestras de ADN en función de su peso molecular.
Comprender los principios detrás de esta técnica., sus aplicaciones clave, y el uso adecuado es esencial para cualquiera que trabaje con análisis de ADN en biología molecular., forense, diagnóstico clínico, y más. Esta guía proporcionará una descripción completa de la electroforesis de ADN..
¿Cuál es el principio detrás de la electroforesis del ADN??
La separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis se basa en la migración de moléculas de ADN cargadas negativamente a través de una matriz de gel de agarosa bajo la influencia de un campo eléctrico..
Los principios clave son:
- Las moléculas de ADN tienen una carga negativa uniforme debido a su columna vertebral de fosfato.. Esto significa que su relación carga-masa es constante..
- Cuando se aplica una corriente eléctrica, Las moléculas de ADN cargadas negativamente serán atraídas hacia el electrodo positivo..
- El gel de agarosa proporciona un efecto de tamizado que hace que los fragmentos de ADN más pequeños migren más rápido que los más grandes..
- Por lo tanto, con el tiempo, Los fragmentos de ADN se separan por tamaño., con fragmentos más pequeños más cerca del electrodo positivo en comparación con los más grandes.
¿Cómo funciona un gel de agarosa??
Los geles de agarosa están compuestos de polímeros de agarosa extraídos de algas marinas.. Cuando el polvo de agarosa se disuelve en un tampón y se deja reposar, forma un gel que contiene poros pequeños.
Las características de los geles de agarosa incluyen:
- La concentración de agarosa determina el tamaño de los poros.. Los porcentajes más altos hacen que los poros sean más pequeños..
- Los tamaños de poro más pequeños ralentizan la migración pero proporcionan una mejor separación de pequeños fragmentos de ADN.. Los poros más grandes permiten una migración más rápida pero una resolución más baja.
- Los geles se sumergen en un tampón conductor que mantiene un pH constante durante la electroforesis.. Los buffers comunes son TAE y TBE..
- Se añade un tinte intercalado como el bromuro de etidio.. Este tinte se inserta entre las bases del ADN y permite la visualización de bandas de ADN bajo luz ultravioleta..
Qué se necesita para realizar la electroforesis de ADN?
El equipamiento básico y materiales para electroforesis en gel de agarosa son:
- gel de agarosa –Típicamente 0.5-2% concentración de agarosa. Mayor porcentaje para una mejor separación de pequeños fragmentos.
- Bandeja de gel y peine– Para moldear el gel con pocillos de muestra..
- Tanque de electroforesis– Alberga el gel y el tampón.. Contiene electrodos para aplicar corriente..
- Fuente de alimentación –Aplica una corriente eléctrica constante., normalmente 50-150 V.
- Buffer – Comúnmente TAE o TBE para sumergir el gel.. Conduce corriente.
- cargando tinte– Contiene glicerol y azul de bromofenol para agregar densidad y color a las muestras de ADN antes de cargarlas en los pocillos..
- escalera de ADN– Un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos.. Se utiliza para identificar tamaños de banda de muestra..
- tinte de tinción – Bromuro de etidio o alternativa para visualizar bandas de ADN bajo luz ultravioleta.
¿Cuáles son los pasos clave en la electroforesis de ADN??
Los pasos clave en la electroforesis de ADN son los siguientes:
- Haga un gel de agarosa con el tamaño de poro deseado y colóquelo en la bandeja de gel..
- Agregue tinte para teñir al gel..
- Cargue la escalera de ADN y las muestras mezcladas con tinte de carga en los pocillos..
- Sumergir el gel en el tampón de electroforesis en el tanque..
- Coloque electrodos y aplique una corriente para hacer funcionar el gel..
- Apague la corriente una vez que el frente de tinte haya migrado una distancia adecuada.
- Visualice bandas de ADN bajo luz ultravioleta y fotografíelas para su análisis..
- Compare los tamaños de las bandas con la escalera del ADN para determinar las longitudes de los fragmentos..
- Extraiga bandas de ADN del gel para aplicaciones posteriores si es necesario.
¿Cuáles son las principales aplicaciones de la electroforesis de ADN??
Hay muchos usos importantes de la electroforesis de ADN en la investigación., diagnóstico clínico, forense, y biotecnología:
- Confirmar el éxito de la extracción de ADN o PCR amplificación visualizando la presencia y cantidad de ADN.
- Verifique los tamaños de los fragmentos de ADN después de la PCR, clonación, o resúmenes de restricción.
- Comparar perfiles de ADN para pruebas de identidad en medicina forense.
- Detectar inserciones de genes, eliminaciones, o mutaciones asociadas con trastornos genéticos.
- Separar y purificar fragmentos de ADN de un tamaño específico., p.ej. para clonación.
- Cuantificar cantidades relativas de ADN entre muestras por intensidad de banda.
- Compruebe si hay degradación del ADN o contaminantes de bandas difusas o múltiples.
- Preparar ADN para secuenciar, manchas del sur, o ensayos de cambio de movilidad electroforética.
¿Cuáles son algunas consideraciones clave al utilizar geles de ADN??
A continuación se detallan algunas consideraciones clave que se deben tener en cuenta al ejecutar geles de ADN.:
- Elija una concentración de agarosa adecuada para los tamaños de fragmentos esperados..
- Incluir una escalera de ADN en al menos un carril para permitir la identificación del tamaño de la banda..
- Mezcle bien las muestras con el tinte de carga antes de cargar los pocillos..
- Evite sobrecargar los pocillos de muestra con demasiado ADN.
- Utilice geles con el voltaje adecuado: voltajes más altos pueden causar distorsiones de banda.
- Detenga la electroforesis una vez que el frente de tinte haya migrado una distancia adecuada.
- Utilice protección al visualizar el ADN con luz ultravioleta..
- Fotografía los geles rápidamente antes de que las bandas se difundan demasiado.
- Al escindir bandas de ADN., Utilice un bisturí limpio en una bandeja UV para cada fragmento..
Conclusión
Entonces, La electroforesis de ADN es una técnica esencial que utiliza la migración de moléculas de ADN cargadas a través de una matriz de gel de agarosa bajo una corriente eléctrica para separar fragmentos por tamaño.. Las aplicaciones clave incluyen la visualización de productos de PCR., analizando el ADN genómico, y purificación preparativa de fragmentos de ADN.. Se debe prestar especial atención a los principios y detalles técnicos al realizar la electroforesis para obtener resultados óptimos.. Con práctica, La electroforesis de ADN se convierte en una técnica fiable para muchos laboratorios de biología molecular..
Preguntas frecuentes
¿Por qué la electroforesis separa el ADN por tamaño??
A pesar de tener la misma densidad de carga, El efecto tamizador de los poros del gel de agarosa hace que la fricción del ADN sea proporcional al tamaño. – Los fragmentos más pequeños encuentran menos resistencia.. Esto da como resultado una separación basada en el tamaño..
¿Qué tan preciso es estimar el tamaño de los fragmentos a partir de una escalera de ADN??
La comparación con una escalera proporcionará una aproximación de los tamaños de las bandas., generalmente dentro 10% exactitud. Un dimensionamiento más preciso requiere un análisis de fragmentos especializado.
¿Por qué se pasa una escalera con el mismo gel que las muestras??
Ejecutar una escalera de ADN junto con las muestras le permite visualizar la migración en ese gel específico y tener en cuenta cualquier distorsión en la migración dentro de la banda..
¿Puedes cuantificar la cantidad de ADN directamente a partir de la intensidad de la banda??
Si bien las intensidades relativas proporcionan una estimación, La cuantificación precisa del ADN requiere instrumentos especializados como espectrofotómetros o fluorómetros..
¿Por qué son crujientes?, bandas claras importantes en la electroforesis de ADN?
Las bandas nítidas de ADN indican que está intacto., fragmentos de ADN puro. Las bandas o frotis difusos sugieren ADN degradado o contaminantes como restos de cebadores o sales que interfieren.
¿Puede la electroforesis separar el ADN por secuencia??
No, La electroforesis en gel de agarosa separa solo por tamaño.. Sin embargo, Técnicas especiales como DGGE también pueden separar basándose en diferencias menores de secuencia..
