Ribonucleasa h, o RNase H para abreviar, es una enzima endoribonucleasa con la capacidad desconcertante de hidrolizar específicamente los enlaces fosfodiéster de una cadena de ARN que se hibridan al ADN. Aunque su actividad parece paradójica, La RNasa H juega un papel crucial en los procesos celulares fundamentales al dirigir selectivamente las porciones de ARN en los híbridos de ARN-DNA. La naturaleza explosiva de sus habilidades de escisión específicas del sitio lo convierte en una herramienta versátil en técnicas de biología molecular.
Aquí exploraremos en profundidad lo que hace RNase H, Cómo funciona, Las características clave y las aplicaciones del producto RNase H recombinante de NEB, y ayudar a los investigadores a elegir la enzima RNase H correcta para sus necesidades.
¿Cuál es la función de RNase H??
La función principal de la RNasa H es escindir la cadena de ARN de los dúplex de ARN-DNA, Dejando el hilo de ADN intacto. Esta digestión de ARN dirigida ayuda a resolver las intersecciones híbridas de ARN-DNA que pueden formarse durante las transacciones de ADN y ARN dentro de las células. La actividad de la ARNasa H es crucial para varios procesos metabólicos de ADN y ARN como la replicación del ADN, transcripción, y la maduración del fragmento de Okazaki.
Evita que los cebadores de ARN persistan en el ADN y elimina las transcripciones de ARN hibridadas a plantillas de ADN complementarias. Este proceso de orientación y descomposición de la porción de ARN específicamente mientras protege la porción de ADN es fundamental para el papel que juega la RNasa H en la facilitación de las transacciones de ácido nucleico in vivo.
¿Cómo funciona la RNasa H y cuál es su actividad enzimática??
RNase H funciona ubicando regiones híbridas de ARN-ADN y luego escindiendo con precisión los enlaces de fosfodiéster entre los 3′-Grupo hidroxilo del ARN ribosa y el grupo fosfato de la siguiente ARN ribosa en la cadena. Cataliza una reacción de hidrólisis ácida-base sin alterar la integridad del hilo de ADN.
A nivel molecular, RNase H reconoce las uniones de ARN-DNA y se une fuertemente a la estructura dúplex. Su sitio activo luego recorta los enlaces fosfodiéster del hilo de ARN uno por un procedimiento en el 3′ a 5′ dirección. Este proceso continúa hasta que todo el segmento de ARN se degrada sin afectar al compañero de ADN. Esta actividad enzimática dirigida se conoce como actividad de RNasa H y se cuantifica como la cantidad de ARNasa H requerida para escindir una cantidad específica de ARN en un híbrido de ARN-DNA dentro de un período determinado en condiciones definidas.
¿Cuáles son las características y aplicaciones clave del producto RNase H de NEB??
New England Biolabs o Neb es un proveedor líder de enzimas de alta calidad para aplicaciones de biología molecular. Su RNasa H recombinante es una enzima refinada con varias características ventajosas. Se suministra junto con un tampón de reacción optimizado para soportar su actividad en un amplio rango de pH y temperatura. Como producto recombinante, Ofrece consistencia entre lotes sin contaminantes.
La RNasa H de NEB muestra una alta función y especificidad de RNasa H, digerir la cadena de ARN con NEB RNasa H de un híbrido de ARN-ADN selectivamente sin perturbar el ADN. Tiene aplicaciones en técnicas como la transcripción inversa PCR (RT-PCR) donde ayuda a resolver los híbridos de ADNm de ARN formados durante la síntesis de primera cadena por actividad de RNasa H. La RNasa H termostable de NEB también está disponible para aplicaciones de ácido nucleico de alta temperatura.
¿Qué condiciones y amortiguadores son necesarios para una actividad óptima de RNasa H??
Para una actividad óptima de RNasa H, La RNasa H recombinante de NEB requiere condiciones de reacción específicas y componentes del tampón. El tampón de reacción RNase H suministrado consiste en Tris-HCl, KCL, MgCl2, y DTT para mantener la resistencia iónica correcta y el pH para la función enzimática máxima. RNase H funciona mejor en PH 8.3 y 37 ° C. La inclusión de iones Mg2+ en el tampón es importante ya que la función RNasa H depende de Mg2+ para su actividad catalítica.
DTT actúa como un agente reductor para proteger la enzima de la oxidación. Las reacciones se configuran combinando la enzima RNasa H, Híbrido y tampón de ARN-ARN de sustrato a una concentración de 1x. La amortiguación adecuada mejora la estabilidad de la ARNasa H y la escisión constante del resto de ARN de los híbridos.
¿Qué tipos de ácidos nucleicos actúan y no actúan?
Aunque la RNase H se dirige selectivamente a ARN en dúplex de ARN-DNA, No digera ARN o ADN monocatenario. Tampoco se escinde ADN de doble cadena. Su actividad de ARNasa H enzimática precisa es particular para el ARN hibridado a la cadena de ADN. La enzima identifica y degrada de manera eficiente la porción de ARN de un heteroduplex de ARN-DNA sin perturbar la integridad y continuidad de la pareja de ADN.
La RNasa H exhibe poca o ninguna actividad en hilos de ácido nucleico singular o en moléculas de ADN de doble cadena que carecen de una unión de ADN de ARN. Esta estricta especificidad del sustrato permite la eliminación de ARN controlado y dirigido de complejos híbridos esenciales para varias transacciones de ácido nucleico.
¿Cuál es la fuente y el método de producción para la RNasa H recombinante de NEB??
La RNasa H de NEB se produce recombinantemente en E. coli para alta pureza y consistencia entre lotes. La fuente de clonación es el gen RNasa H nativo aislado de Escherichia coli que codifica la RNasa H endógena presente en las células E. coli. Este gen se inserta en un vector de expresión y se amplifica en una cepa E.Coli no patógena. La inducción del vector conduce a la expresión de la proteína RNasa H de alto nivel RNasa H.
La RNasa H sobreexpresada se purifica luego utilizando cromatografía de columna para obtener una preparación altamente purificada libre de nucleas de contaminación. Los controles de control de calidad certifican la enzima recombinante exhibe actividad y especificidad de RNase H. El producto final se suministra junto con un tampón de reacción optimizado para su función.
¿Cómo se usa la RNasa H de NEB en técnicas de biología molecular como RT-PCR??
Una aplicación importante de RNasa H es la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) donde ayuda a resolver los híbridos de ADNm de ARN formados durante la primera cadena síntesis de ADNc. En RT-PCR, Una plantilla de ARN se transcribe primero a su ADN complementario (ADNc) Usando una imprimación de ADN. Este proceso da como resultado dúplex híbridos de ADNm de ARN. La RNasa H recombinante de NEB se usa luego para degradar selectivamente la cadena de ARN de estos híbridos, dejando solo ADNc monocatenario.
Degradar la plantilla de ARN original evita que interfiera con la amplificación de PCR posterior. Al escindir el ARN de manera efectiva, RNase H permite la amplificación exponencial de solo el ADNc para detectar y analizar transcripciones de ARN específicas. Su precisión y eficiencia en la degradación del ARN hibridado en condiciones optimizadas mejoran la calidad y la sensibilidad del análisis RT-PCR.
¿Cuáles son los rangos de temperatura y los puntos de inactivación de calor para la RNase H de NEB??
La RNasa H regular de NEB está activa entre 25-42 ° C con una actividad máxima de alrededor de 37 ° C. Se inactiva irreversiblemente al calentar a 65 ° C para 20 minutos. Para aplicaciones que requieren temperaturas más altas, NEB también ofrece una variante termostable de RNase H. Esta RNasa H resistente al calor es completamente funcional entre 25-80 ° C con una actividad creciente a temperaturas elevadas de hasta 50-60 ° C.
Permanece estable incluso después de calentar a 80 ° C, haciéndolo adecuado para exigentes técnicas de ácido nucleico que se ejecutan en condiciones de ciclo térmico más altos. La ARNasa H termostable puede resistir los pasos de inactivación de calor y el tratamiento con proteinasa K, ofreciendo más flexibilidad. Ambas versiones de RNase H se suministran junto con una amplia documentación del producto para un uso efectivo.
Cómo elegir entre RNase H regular y termostable de NEB?
La elección entre RNasa H regular y termoestable depende de los requisitos de temperatura y el flujo de trabajo. RNase H regular es una opción rentable si las reacciones se pueden realizar por debajo de 42 ° C, Como en RT-PCR estándar. La RNasa H termostable ofrece ventajas para técnicas que involucran ciclos de calor elevados de 50-80 ° C como PCR anidada, Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (Lámpara), y otras aplicaciones de perfiles térmicos. Sus propiedades resistentes al calor evitan su pérdida de actividad durante múltiples pasos de calentamiento.
Los investigadores que realizan un análisis de ácido nucleico de alta temperatura se benefician del rango funcional extendido y la durabilidad de la RNasa H termostable. En general, Las enzimas RNasa H recombinantes de NEB proporcionan herramientas confiables para la digestión de ARN controlada en los complejos de ARN-ADN en una amplia gama de usos.
Resumen
En conclusión, Esta publicación de blog tenía como objetivo explicar de manera exhaustiva qué es RNase H, cómo funciona específicamente, Los atributos clave de los productos RNase H recombinantes de NEB, Condiciones de reacción óptimas, Aplicaciones en técnicas como RT-PCR, y consideraciones para elegir la enzima RNase H correcta.
Al profundizar en su intrigante actividad enzimática y habilidades de escisión de ARN dirigida de una manera simple pero detallada, Espero que esto ayude a arrojar más luz sobre la versátil RNasa H y su importante papel en las transacciones de ácido nucleico.. Avíseme si algún otro aspecto necesita más aclaraciones.
