¿Qué es PCR-SSCP?? Las aplicaciones y la guía completa

Con el desarrollo de técnicas de biología molecular, Varios métodos para detectar estructuras génicas y mutaciones han surgido continuamente. Especialmente después del advenimiento de PCR tecnología, Varias técnicas de detección de genes combinadas con PCR han impulsado aún más el avance de la investigación de genes. Técnicas como la secuenciación directa de productos de PCR asimétricos, escisión de ribonucleasa (R lo mejor), y análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) se han convertido en herramientas poderosas para el análisis de genes. Sin embargo, Estos métodos son relativamente engorrosos de operar, tener limitaciones significativas, o requerir altas condiciones experimentales, haciéndolos inadecuados para laboratorios clínicos generales.

Introducido en 1989, PCR-SSCP (Polimorfismo de conformación de una sola cadena) se ha sometido a una mejora y refinamiento continuos, haciéndolo más simple, más rápido, y método más sensible para detectar mutaciones génicas. No solo se usa para detectar mutaciones puntuales y deleciones e inserciones de secuencia corta, sino que también se aplica en cuantificación de ADN, Monitoreo de contaminación cruzada en experimentos de diagnóstico de PCR, e investigar fuentes de infección. Debido a las ventajas sobresalientes de SSCP, se ha aplicado ampliamente en los últimos años.

Principios y características de SSCP

• Descubrimiento y concepto básico:
  • ADN monocatenario (ADNss) Los fragmentos exhiben conformaciones complejas de plegamiento espacial mantenidas por interacciones intramoleculares, Principalmente emparejamiento de bases.
  • Un solo cambio base puede alterar significativamente o ligeramente la conformación espacial, dando como resultado diferentes patrones de migración en el gel de poliacrilamida.
• Mecanismo de separación:
  • Electroforesis en gel de poliacrilamida no denunciadora (PÁGINA) pueden separar bruscamente las moléculas de ssDNA con diferentes conformaciones debido a niveles variables de obstrucción en el gel.
• Análisis de SSCP:
  • Nombrado polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP) por el investigador japonés Orita y sus colegas.
  • Aplicado para detectar mutaciones genéticas en productos amplificados por PCR, Mejora de la simplicidad y sensibilidad.
• Proceso básico:
  1. Amplificación por PCR: Amplificar el ADN objetivo.
  2. Desnaturalización y renaturación: Desnaturalizar los productos de PCR específicos y la renombra rápidamente para formar moléculas de ADN monocatenarios con estructuras espaciales específicas.
  3. Página no intrigante: Realice la electroforesis en gel de poliacrilamida no deninaturalizante en una cantidad apropiada de ADN monocatenario.
  4. Detección: Analice los resultados utilizando autorradiografía radiográfica, manchas de plata, o tinción de bromuro de etidio.
• Interpretación:
  • Un cambio en la tasa de migración de ssDNA en comparación con el control normal indica un cambio en la conformación, sugiriendo una mutación base en ese fragmento de ADN.
• Ventajas:
  • Simple, rápido, y método sensible.
  • No requiere equipo especializado.
  • Adecuado para laboratorios clínicos.
• Limitaciones:
  • Solo detecta mutaciones; Se necesita una secuencia adicional para identificar la posición exacta y el tipo de mutación.
  • Se requieren condiciones estrictas de electroforesis.
  • Posibles falsos negativos si las mutaciones puntuales no alteran significativamente la conformación de ssDNA o si otras condiciones interfieren.
• Eficiencia de detección:
  • A pesar de las limitaciones, SSCP cuenta con una alta tasa de detección en comparación con otros métodos.
  • Capaz de identificar mutaciones base desconocidas dentro del fragmento de ADN objetivo.
  • Takao demostró que SSCP puede detectar 90% de mutaciones de base única en fragmentos de ADN más cortas que 300 pb.
• Otras aplicaciones:
  • SSCP puede separar el ADNmt mutante con diferentes tasas de migración a través de la electroforesis en gel de poliacrilamida.
  • Permite una purificación e identificación adicionales de fragmentos de ADN mutantes a nivel de secuencia.

Desarrollo y mejoras de SSCP

• Desarrollo inicial:
  • Inicialmente, SSCP involucró la incorporación de isótopos en productos de amplificación de PCR, y los resultados se mostraron a través de la autorradiografía. Esto planteó desafíos para una adopción generalizada.
• Simplificación:
  • La combinación de tinción de plata de ADN con PCR-SSCP, particularmente la aplicación de tinción directa de bromuro de etidio, simplificó enormemente el método.
• Mejoras notables recientes:
  • Análisis de ARN-SSCP:
    • El principio básico: El ARN tiene conformaciones secundarias y terciarias más intrincadas, haciéndolo altamente sensible a las mutaciones de una sola base, aumentando así las tasas de detección.
    • La tasa de detección de mutaciones puede exceder 90%.
    • El ARN es menos propenso a formar hilos dobles, permitiendo que se use una cantidad mayor en electroforesis, que es beneficioso para la tinción de bromuro de etidio.
    • Sin embargo, Este método agrega un paso de transcripción inversa y requiere cebadores más largos que contienen secuencias de promotores de ARN polimerasa, Aumento de la complejidad.
• Combinando SSCP con otros métodos de detección de mutaciones:
  • Análisis heteroduplex (Él):
    • Mejora las tasas de detección significativamente cuando se combina con SSCP.
    • Implica hibridar una sonda con el ssDNA o ARN objetivo. Los hilos híbridos que contienen un par de bases no coincidentes se pueden separar de hilos híbridos completamente complementarios a través de electroforesis en gel PAG no denunciado.
    • Realizar el análisis SSCP y HET en la misma secuencia objetivo puede lograr cerca 100% tasa de detección para mutaciones puntuales, mientras mantiene la simplicidad experimental.

El procedimiento de PCR-SSCP

Preparación de gel basada en la longitud del fragmento de ADN

Para fragmentos de ADN más cortos que 1kb, Elija la concentración de gel de poliacrilamida de la siguiente manera:

• Longitud del fragmento de ADN (pb): % Concentración de acrilamida
  • 1KB - 700B: 3.5%
  • 700B - 500B: 5%
  • 500B-200B: 8%
  • 200b: 12%

Pre-SSCP Pre-SSCP

• Amplificación por PCR: Amplificar un producto específico con mínimo de manchas (Confirmado por electroforesis en gel de agarosa).

1. Preparación de gel de poliacrilamida (Rastrear)

• Prepare la solución de gel en función de la concentración requerida de la tabla anterior.
• Inserte un peine en el molde de gel.
• Vierta la solución de gel de un extremo del peine, Inclinando el molde hacia el extremo del vertido a medida que el gel alcanza los dientes de peine para evitar la formación de burbujas.
• Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente para 1 hora.
• Retire el peine y agregue 1 × tbe buffer en la parte superior del gel para cubrirlo.

2. Electroforesis

1. Llevar 10 μl de producto PCR.
2. Agregar 10 μL de agente desnaturalizante (95% formamida, 10 MMOL/L EDTA, 0.02% bromofenol azul).
3. Agregar 30 μl de aceite mineral.
4. Hervir 5 minutos, Luego, colóquelo inmediatamente en un baño de hielo por al menos 2 minutos.
5. Cargue toda la fase acuosa en el gel.
6. Realizar electroforesis a 10-15 ° C:
   • Comience con 300V para 5 minutos.
   • Continuar con 120V para 8 horas.
7. Después de la electroforesis, manchar el gel en 1 × tbe buffer que contiene 0.5 μg/ml de bromuro de etidio para 30-45 minutos.
8. Observe bajo luz ultravioleta o proceda a manchas de plata.

3. Manchas de plata

1. Lave el Pag dos veces con agua desionizada.
2. Arregle el gel en una solución de 10% etanol y 0.5% ácido acético para 6 minutos.
3. Lavar dos veces con agua desionizada.
4. Sumergirse en 0.2% nitrato de plata (Agno3) solución para 10 minutos.
5. Lavar 3-5 veces con agua desionizada.
6. Desarrollarse en una solución de 1.5% hidróxido de sodio (Naófica) y 0.4% formaldehído para 7 minutos.
7. Detener el desarrollo con 0.75% carbonato de sodio (Naco3).

Aplicaciones de SSCP

Dado que Orita y sus colegas usaron SSCP para el análisis de polimorfismo de ADN humano, El método se ha empleado ampliamente en varios campos, incluyendo la detección de mutaciones genéticas asociadas con el cáncer y las enfermedades hereditarias, así como en la tipificación de virus y el monitoreo de la contaminación.

Detección de mutación del gen cáncer

• Mutaciones asociadas a tumores:
  • SSCP se usa ampliamente para detectar mutaciones en genes relacionados con varios cánceres como el astrocitoma, tumores cerebrales, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer gástrico, y cáncer colorrectal.
  • Se ha aplicado para detectar mutaciones en el gen p53 en estos tumores y mutaciones del gen Ras en el cáncer de pulmón.
• Aplicaciones exitosas:
  • Recientemente, Sugano et al. Se usa con éxito SSCP manchado de plata para detectar una mutación en la posición 12 del gen C-Ki-Ras2, Completar la electroforesis y el proceso de tinción dentro 2.5 horas.

Investigación de enfermedades hereditarias

• SSCP se utiliza en el estudio de genes involucrados en enfermedades hereditarias como:
  • Fibrosis quística: Detección de mutaciones en el gen CFTR.
  • Tipo de neurofibromatosis 1: Análisis de mutaciones génicas.
  • Poliposis adenomatosa familiar: Investigación de genes relacionados con esta condición.
• RNA-SSCP vs. ADN-SSCP:
  • Sharkar et al. usado RNA-SSCP para detectar secuencias génicas en 28 pacientes con hemofilia B.
  • Comparación con el ADN-SSCP y la secuenciación de genes directos revelados 20 Mutaciones básicas en el gen del factor IX de 2.6kb, con detección de RNA-SSCP 70% de estas mutaciones en comparación con 35% detectado por DNA-SSCP, Demostrando una mayor sensibilidad de RNA-SSCP.

Monitoreo de virus y contaminación

• Tipificación de virus:
  • SSCP se usa para la contaminación por tipificación y monitoreo de virus en los experimentos de PCR.
  • YAP usó PCR anidada para detectar muestras de VHB de diferentes regiones, seguido por el análisis SSCP, que reveló distintos patrones SSCP para cada muestra, indicando variaciones regionales en el ADN del VHB y eliminando la posibilidad de contaminación cruzada.
• Monitoreo de contaminación:
  • SSCP sirve como un método confiable para garantizar la precisión de los resultados de diagnóstico de PCR.

Estudios de transmisión de patógenos

• SSCP se utiliza para estudiar las rutas de transmisión de los patógenos.

Análisis de ADN cuantitativo

• Análisis de células de cáncer de mama:
  • SSCP, combinado con PCR competitiva, se usó para el análisis cuantitativo de genes mutantes p53 en células de cáncer de mama.
  • La ventaja del método radica en el uso de estándares internos que difieren del ADN objetivo en una sola base, Garantizar condiciones de amplificación idénticas y, por lo tanto, una cuantificación de ADN más precisa.

Precauciones para SSCP

SSCP es un rápido, simple, y método sensible para detectar mutaciones génicas. Para lograr resultados óptimos, Se deben observar las siguientes precauciones:

Repetibilidad:

• Los principales factores que afectan la repetibilidad de SSCP son el voltaje de electroforesis y la temperatura. Mantener estas condiciones constantes asegura una buena repetibilidad de los patrones de SSCP.
• Generalmente, Los patrones de SSCP muestran dos bandas de ADN monocatenarios, pero a veces solo una o más de tres bandas pueden aparecer debido a conformaciones espaciales similares entre dos moléculas de ADN monocatenarios. La presencia de más de tres bandas puede indicar una mezcla de fragmentos de ADN de tipo salvaje y mutante.

Impacto de la longitud de la secuencia de ADN objetivo:

• SSCP es más efectivo para detectar mutaciones puntuales en secuencias de ADN o ARN más cortas que en las más largas. Esto podría deberse a que los cambios de base única en las moléculas más largas tienen un impacto menor en el mantenimiento de la conformación espacial.
• Algunos investigadores creen que para las cadenas de ADN más cortas que 400 pb, La longitud no afecta la efectividad de SSCP. La selección cuidadosa de condiciones experimentales puede lograr una tasa de detección de más 90% para mutaciones puntuales en 354 Fragmentos de ADN de BP.

Voltaje y temperatura de electroforesis:

• Para mantener conformaciones espaciales estables de ADN monocatenario, SSCP debe realizarse a temperaturas más bajas (típicamente entre 4 ° C y 15 ° C). Alto voltaje al comienzo (250V) para 5 Los minutos ayudan a separar inicialmente el ADN monocatenario con diferentes conformaciones sin aumentar significativamente la temperatura del gel.. Esto debe ser seguido por un voltaje más bajo (alrededor de 100V) Para separar aún más los hilos.
• El voltaje exacto para la electroforesis debe determinarse en base a condiciones experimentales específicas.

Impacto de la posición de mutación puntual:

• La posición de una mutación puntual en el ADN o el ARN afecta las tasas de detección de SSCP en función de su papel en el mantenimiento de la conformación espacial, en lugar de su posición lineal en la cadena.
• Las mutaciones en la región central del ADN son generalmente más fáciles de detectar en comparación con las que están cerca de los fines.
• Sin embargo, Incluso las mutaciones en la región central pueden quedarse sin ser detectadas si no alteran significativamente la conformación espacial. Por ejemplo, El estudio de White encontró que solo 2 fuera de 9 Se detectaron muestras con mutaciones puntuales en el bucle de una estructura de horquilla, indicando una tasa de detección de 22%.

Interpretando los resultados de SSCP:

• SSCP separa el ADN monocatenario basado en la conformación espacial en lugar del peso o carga molecular. A veces, Las tasas de migración de las cadenas normales y mutantes son muy cercanas, haciendo que sea difícil distinguir entre ellos.
• Típicamente, longitud de electroforesis de 16-18 Se requiere que CM determine con precisión los resultados basados ​​en el límite de detección, que es la diferencia de distancia de electroforesis discernible más pequeña entre fragmentos de ADN mutantes y normales.
• Si la distancia es mayor que el límite de detección (p.ej., 3milímetros), Se indica una mutación. Una distancia más pequeña sugiere que no hay cambios. Establecer un límite de detección bajo puede conducir a falsos positivos.
• Otras condiciones, como la cantidad de producto PCR cargado, El grado de reticulación de PAG, y concentración de gel, debe seleccionarse en base a requisitos experimentales específicos.

Detalles de PCR-SSCP por pasos

Preparación de la muestra

1. Amplificación y detección de PCR:
   • Realice la amplificación de PCR utilizando los cebadores apropiados y seleccione la temperatura de recocido adecuada.
   • Detectar los productos de amplificación ejecutándolos en un 2-2.5% gel de agarosa a través de la electroforesis horizontal. Carga 3-5 µl del producto de PCR.
   • La concentración óptima del producto de PCR debe estar cerca 10 ng/µl.
2. Mezclar el producto de PCR con búfer desnaturalizante:
   • Agregar 5 µl de tampón de muestra SSCP (amortiguador desnaturalizante, Igual que el búfer de secuenciación en “Clonación molecular”) al fondo de un tubo de PCR limpio.
   • Agregue el producto de amplificación por PCR al centro del búfer. Ajuste la cantidad en función de la visibilidad de la banda en el gel de agarosa:
     • Si la banda es brillante, agregar 1 l.
     • Si el resultado es excelente, agregar 0.5 l.
     • Si la banda no está muy clara, agregar 1.5, 2, o 3 µl en consecuencia.
   • Aumentar la cantidad de tampón de muestra proporcionalmente, p.ej., para 3 µl del producto PCR, agregar 8 µl de tampón para una mejor desnaturalización.
3. Desnaturalización del producto PCR:
   • Centrifugarse el tubo para concentrar la muestra en la parte inferior.
   • Desnaturalizar la muestra a 95 ° C para 10 minutos usando un máquina de PCR, Luego, coloque inmediatamente el producto de PCR en hielo para 5 minutos para evitar la renaturación.

   Nota: Pasos 3 y 4 se puede realizar después del cuarto paso de la preparación del gel mientras espera que el gel se solidifique.

Preparación de gel

1. Preparando las placas de vidrio:
   • Enjuague cada par de placas de vidrio con agua del grifo seguido de DDH2O.
   • Secia las placas de vidrio con papel absorbente y luego limpie con etanol anhidro.
   • Permitir que el etanol se evapore para 2-3 minutos.
   • Ensamble las placas de vidrio y colóquelas en el puesto de fundición de gel, Asegurar que se aseguran ambos lados y el fondo.
   • Apriete los tornillos de montaje para mantener las placas niveladas. (Verifique si hay fugas con etanol anhidro.)

Geles grandes (50% Concentración de glicerol)

Geles pequeños (50% Concentración de glicerol)

Gel

1. Mezclar el gel: Después de preparar la solución de gel de acuerdo con la formulación proporcionada, Mezclarlo a fondo para garantizar la uniformidad.
2. Verter en placas de vidrio: Vierta cuidadosamente la solución de gel preparada en las placas de vidrio ensambladas. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas durante el proceso de vertido. Si se observan burbujas, Incline suavemente las placas para permitir que las burbujas se suban a la superficie. Tocar ligeramente los lados de las placas puede ayudar a liberar burbujas de aire atrapadas.
3. Insertando el peine: Una vez que el nivel de solución de gel alcanza aproximadamente 0.5 cm debajo del borde superior de las placas de vidrio, Inserte el peine en el gel. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre los dientes de peine y la superficie del gel.. Si hay burbujas presentes, Retire el peine, Libera las burbujas, y reinsertar el peine con cuidado.
4. Permitiendo la polimerización de gel: Después de insertar el peine, Permita que el gel se polimerice colocando las placas planas o en un ligero ángulo (menos que 10 grados) en una superficie de nivel para aproximadamente 30 minutos. Durante este tiempo, el gel polimerizará y solidificará.

Nota: Este también es un momento adecuado para proceder con la desnaturalización de las muestras de PCR como se describe en los pasos 3 y 4 de la primera sección.

Carga de gel

• Colocando el gel:
  • Retire el peine del gel de inmediato después de la polimerización.
  • Asegúrese de que se aplique fuerza uniforme para mantener la integridad de los pozos.
  • Asegure la placa de gel en el aparato de electroforesis con el lado del pozo hacia adentro.
  • Transición de la placa de gel al tampón de electroforesis lentamente para evitar grandes burbujas de aire.
• Preelectroforesis:
  • Agregue 1 × tampón de electroforesis TBE al depósito superior hasta que el nivel del líquido esté a aproximadamente 1 cm sobre el borde más corto de la placa de vidrio.
  • Asegúrese de que no haya fugas desde el depósito superior.
  • Establezca el voltaje en 140-150V para el aparato grande y 110-120V para el aparato pequeño.
  • Preelectroforesis para aproximadamente 10 minutos.
• Carga de muestra:
  • Agregue secuencialmente muestras preparadas en los pozos del gel usando una microsiringe.
  • Evite cargar muestras en los dos pozos más cercanos a los bordes de cada placa de gel..
• Electroforesis:
  • Establezca el voltaje en 140-150V para el aparato grande y 110-120V para el aparato pequeño.
  • Realizar electroforesis a una temperatura de 10-15 ° C durante un mínimo de 10 horas.

Manchas

• Fijación:
  • Retire el gel del aparato, Marque el punto de partida, y sumergirlo en 70% etanol para 15 Minutos en un agitador.
  • Recupere el etanol después de la fijación y enjuague dos veces con agua destilada durante aproximadamente 3 minutos por enjuague.
• Manchas:
  • Manchar el gel en la solución de tinción (200ML que contiene 3.6% NaOH 4.2 ml, 20% Agno3 3.6 ml, amoníaco 2ml) para 30 minutos.
  • Ajuste el tiempo de tinción si manchan dos geles simultáneamente.
• Desarrollo:
  • Desarrollar el gel en la solución en desarrollo (200ML que contiene 1% citrato de sodio 1 ml, formaldehído 100ul) Hasta que las bandas sean claramente visibles.
  • Enjuague tres veces con agua destilada para 3 minutos cada uno para detener el desarrollo.
  • Alternativamente, mancha el gel sumergiéndolo en 1 × tampón TBE que contiene 0,5ug/ml de bromuro de etidio para 10 minutos y visualizar bajo luz ultravioleta

Fórmulas

10× tbe fórmula:

• Base de tris: 108gramo
• Ácido bórico: 55gramo
• 0.5mol/l edta (pH 8.0), Volumen ajustado a 1L

Fórmula de amortiguador desnaturalizante:

• 98% Formamida desionizada
• 10MMOL/L EDTA (pH 8.0)
• 0.025% Xileno cianol FF
• 0.025% Bromofenol azul

Notas:

1. Reproducibilidad:
   • Mantener el voltaje y la temperatura estables durante la electroforesis es el factor principal que afecta la reproducibilidad de SSCP.
   • Típicamente, Los patrones de SSCP muestran dos bandas de ADN monocatenarios, Pero a veces solo pueden aparecer una o tres o más bandas, Posiblemente debido a la presencia de conformaciones tridimensionales similares entre los fragmentos de ADN de tipo salvaje y mutante.
2. Influencia de la longitud de la secuencia de ADN objetivo:
   • SSCP tiene una tasa de detección más alta para mutaciones puntuales en ADN de cadena corta o ARN en comparación con el ADN de cadena larga. Esto es probable porque los cambios de base individuales en el ADN de cadena larga y las moléculas de ARN tienen un efecto menor en el mantenimiento de las conformaciones tridimensionales.
   • En el caso de las cadenas de ADN más cortas (por debajo de 400bp), La longitud del ADN no afecta la efectividad de SSCP.
3. Efectos del voltaje y temperatura de la electroforesis:
   • Para mantener una conformación tridimensional estable de ADN monocatenario, SSCP debe realizarse a una temperatura más baja (generalmente entre 4 ° C y 15 ° C).
   • Durante la electroforesis, El voltaje excesivo puede causar un aumento de temperatura. Por lo tanto, Al realizar SSCP en un tanque de electroforesis sin un dispositivo de enfriamiento, un voltaje más alto (250V) debe usarse inicialmente, seguido de una reducción a alrededor de 100V para electroforesis.
4. Interpretación de los resultados de SSCP:
   • En análisis SSCP, La separación de fragmentos de ADN monocatenarios se basa en el tamaño de su obstáculo estérico en lugar del peso molecular, así no puede reflejar el peso molecular.
   • La interpretación de los resultados debe basarse en el límite de detección, que se refiere a la diferencia mínima en la distancia electroforética entre los fragmentos de ADN mutantes y normales que se pueden distinguir.
5. Otras consideraciones:
   • Condiciones como la cantidad de producto de PCR cargado, la densidad de reticulación del gel de poliacrilamida, y la concentración del gel debe seleccionarse y determinarse en base a condiciones experimentales específicas.