Introducción
- AFLP es una tecnología de marcador molecular de ADN que detecta el polimorfismo de ADN al restringir la longitud de los fragmentos producidos por las endonucleasas de restricción.
- Las principales características de la técnica AFLP son:
- Requiere una pequeña cantidad de ADN para el análisis, solo 0.5g.
- Exhibe buena reproducibilidad.
- Demuestra un polimorfismo fuerte.
- Ofrece alta resolución.
- No requiere hibridación del sur.
- Adecuado para una amplia gama de muestras.
- Exhibe herencia estable.
- En términos de características técnicas, AFLP es un producto que combina RAPD y RFLP.
- Supera las desventajas de la complejidad y los riesgos radiactivos de la tecnología RFLP, y la inestabilidad y el dominio de los marcadores genéticos en RAPD mientras incorporan las fortalezas de ambos.
- En los últimos años, Esta tecnología se ha mejorado y desarrollado continuamente, Hacer que AFLP se convierta rápidamente en el método molecular más efectivo hasta la fecha.
El principio de AFLP
- AFLP también es una tecnología de marcador molecular de ADN que detecta el polimorfismo de ADN al restringir la longitud de los fragmentos producidos por las endonucleasas de restricción.
- Sin embargo, AFLP implica la amplificación de los fragmentos de corte de enzimas a través de PCR reacción primero, y luego electroforesis de los fragmentos de corte de enzimas amplificados en un gel de secuenciación de alta resolución. El polimorfismo se detecta en base a las diferentes longitudes de los fragmentos amplificados.
- En el experimento, Los fragmentos de corte de enzimas primero se ligan a adaptadores artificiales que contienen extremos cohesivos compatibles. La secuencia de estos extremos cohesivos, junto con la secuencia del adaptador, sirve como sitio de unión para reacciones de PCR posteriores.
- Dependiendo de los requisitos, diferentes cebadores con 1 a 3 Se pueden usar nucleótidos selectivos agregados en los extremos para lograr la amplificación selectiva. Estos nucleótidos selectivos permiten que los cebadores reconozcan selectivamente fragmentos de tala de enzimas con secuencias de emparejamiento específicas, conduciendo a una amplificación específica.
Reactivo utilizado en la prueba
| Reactivos experimentales | Descripción |
|---|---|
| Enzima taq | ADN polimerasa |
| Adaptadores Ecori/MSEI | Adaptadores de enzimas de restricción |
| E+un cebador | Cebadores para la amplificación por PCR |
| Primeros M+C | Cebadores para la amplificación por PCR |
| T4 ADN ligasa | Enzima ADN ligasa |
| Oligonucleótidos E y M | Oligonucleótidos para PCR |
| Agarosa | Matriz de gel para electroforesis |
| Persulfato de amonio | Catalizador para la fundición de gel y la desnaturalización del ADN |
| Acrilamida | Componente de la matriz de gel para secuenciación de alta resolución |
| Urea | Agente desnaturalizante para electroforesis |
| Nitrato de plata | Manchas para visualizar bandas de ADN |
| Formamida | Agente desnaturalizante para geles de secuenciación de ADN |
| dNTP | Desoxinucleótidos trifosfatos para PCR |
| Xileno cianol | Tinte de seguimiento para electroforesis |
| Ácido acético | Utilizado en la preparación de gel |
| Silano de vidrio | Agente de recubrimiento para placas de vidrio en electroforesis en gel |
| 50marcas de BP | Marcador de ADN de 50 pares de bases para referencia de tamaño |
Procedimiento experimental
1. Extracción y purificación de ADN genómico
Consulte los métodos de extracción de ADN.
- Electroforesis de fragmentos de ADN en un 0.8% gel de agarosa (que contiene 0,5 μg/ml de bromuro de etidio, EB), sacar 1/3 del ADN genómico extraído para la purificación.
- En primer lugar, reponer el volumen del ADN extraído con tampón TE a un volumen total de 50 µl.
- Extraiga una vez con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y una vez con cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Centrífuga y transferir el sobrenadante a un tubo de Eppendorf.
- Agregar 1/10 Volumen de NAAC y el doble del volumen de etanol absoluto precoluido, y colocar a -20 ° C por al menos 2 horas. Centrífuga a 10,000 g para 10 minutos.
- Lavar el precipitado de ADN dos veces con 70% etanol, seco al aire, y disolverse en 30 μl tampón TE.
- Medir los valores de A260 y A280 utilizando un UV-2401pc (Shimadzu) Espectrofotómetro UV para cuantificación.
- Electroforesis de fragmentos de ADN en un 0.8% gel de agarosa (que contiene 0.5 μg/ml EB) Para la determinación del tamaño.
Nota:
- Para 0.1-0.2g de tejido, disolver en 100 μl de solución e. Para 0,5 g de tejido, Aumentar la solución E a 300 μl. En este punto, La concentración de ADN es de aproximadamente 100 ng/μl.
2. Restricción de digestión y ligadura de enzimas
En un tubo de centrífuga de 0.2 ml, agregar:
- ADN de plantilla de aproximadamente 250ng,
- 2.5μl 10 × tampón de digestión de enzimas de restricción,
- 2.5μL 10 × t4 t4 tampón ligasa de ADN,
- 5 Unidades de Ecori,
- 5 Unidades de MSEI,
- 2 Unidades de ADN ligasa T4,
- 50Adaptador PMOL MSEI,
- Agua destilada doble a un volumen total de 25 μl.
Incubar la mezcla en un termociclador PCR establecido a 37 ° C durante la noche. Después de la digestión, inactivar las enzimas incubando a 65 ° C para 20 minutos. Almacene la reacción a -20 ° C para su uso posterior como plantilla de preamplificación.
3. Pre-amplificación
Tome 3 μl del producto digerido y ligado de la enzima y agregue:
- 75de e+una imprimación,
- 75de M+C Primer,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 unidad de polimerasa taq,
- 3μL de 10 × tampón PCR,
- Agregue agua destilada doble a un volumen total de 30 μl.
Establezca los parámetros de reacción de PCR de la siguiente manera:
- Desnaturalización inicial a 94°C para 90 segundos,
- Desnaturalización a 94 ° C para 30 segundos,
- Recocido a 56 ° C para 1 minuto,
- Extensión a 72 ° C para 1 minuto,
- Repita los pasos anteriores para 30 ciclos,
- Extensión final a 72°C para 10 minutos (usando un máquina de PCR de la compañía de educación física).
Después de la reacción, Analizar los productos de amplificación por electroforesis en un 0.8% gel de agarosa (que contiene 0.5 μg/ml EB). Tomar 3 μl del producto y diluirlo 50 tiempos para su uso posterior como plantilla para la amplificación selectiva.
4. Amplificación de PCR selectiva
Tome 3 μl del producto diluido y agregue:
- 75de Ecorⅰ Primer selectivo,
- 75de MSEⅰ Primer selectivo,
- 15mm mg2+,
- 25mm dntps,
- 1 Unidad de Polimerasa Taq,
- 3μL de 10 × tampón PCR,
- Agregue agua destilada doble a un volumen total de 30 μl.
Establezca los parámetros de reacción de PCR de la siguiente manera:
- Desnaturalización inicial a 94°C para 90 segundos,
- Desnaturalización a 94 ° C para 30 segundos,
- Recocido a 65 ° C para 1 minuto, luego realizar 13 ciclos (disminuir la temperatura en 0.7 ° C por ciclo),
- Desnaturalización a 94 ° C para 30 segundos,
- Recocido a 56 ° C para 1 minuto,
- Extensión a 72 ° C para 1 minuto, luego realizar 25 ciclos,
- Extensión final a 72°C para 5 minutos (Uso de una máquina de PCR de la compañía PE).
Primero, Analizar los productos de amplificación selectiva por electroforesis en un 0.8% gel de agarosa (que contiene 0.5 μg/ml EB).
5. Electroforesis en gel
Separe los productos amplificados utilizando un 6% gel de poliacrilamida desnaturalizante (0.5MM GRISIÓN) y tampón de electroforesis 1 × TBE (Aparato de electroforesis de secuenciación bio-Rad).
- Retire el peine y pre-ejecutar el gel a una potencia constante de 140W para 30 minutos hasta que la temperatura alcance 47-49 ° C. Asegúrese de lavar la urea de cada pozo.
- Para los productos de amplificación selectivos, Agregue un volumen igual de búfer de carga (98% formamida, 10MM EDTA, 0.25% xileno cianol, 0.25% bromofenol azul) y desnatura a 94 ° C para 5 minutos (Uso de una máquina de PCR de la compañía PE). Después de la desnaturalización, Coloque rápidamente en hielo hasta que cargue.
- Cargue 8 μl de cada muestra en cada carril. Inicialmente, Ejecute el gel a una potencia constante de 100W por aproximadamente 2 minutos para concentrar rápidamente las muestras en el fondo de los pozos. Luego ajuste a una potencia constante de 60W, Mantener la temperatura alrededor de 43 ° C, Hasta que el azul del bromofenol llegue a 2/3 de la distancia desde la parte superior del gel hasta la placa de vidrio. Finalizar la electroforesis.
6. Manchas de plata
- Solución de fijación: Agregue 100 ml de ácido acético glacial a 900 ml de agua desionizada o agua a doble distrito.
- Solución de tinción: Disolver 1G AgNO3 en 1L de agua desionizada, Luego añade 1.5 ml de 37% formaldehído.
- Desarrollo de solución: Disolver 30g NA2CO3, 1.5 ml de 37% formaldehído, y 2 mg de tiosulfato de sodio en 1L de agua desionizada.
- Después de la electroforesis, Coloque la placa de vidrio con el gel en una bandeja de plástico para manchar plata.
- Fijación: Agregue la solución de fijación y agite suavemente un agitador para 30 minutos. Reserve la solución de fijación después de la fijación.
- Enjuague: Lave el gel tres veces con agua desionizada para 2 minutos cada vez.
- Manchas: Coloque el gel en una bandeja de manchas y vierta la solución de manchas (mantenido a 4 ° C). Agitar suavemente a un agitador para 30 minutos. Después de enjuagarse el gel con agua desionizada para 10 segundos, transferirlo a la bandeja en desarrollo.
- Desarrollo: Agregue la solución de desarrollo (mantenido a 4 ° C) y agitarse suavemente hasta que las bandas dejen de aumentar.
- Terminación: Agregue la solución de fijación usada desde el paso 2 y agita por unos minutos. Enjuague con agua destilada durante varios minutos una vez que se logran los resultados óptimos.
- Después de quitar las gotas de agua del gel y el plato de vidrio, colóquelo en una caja de luz y fotografiado con una cámara digital de Nikon.
Resumen
Gracias por proporcionar el procedimiento experimental AFLP completo! Si tiene alguna pregunta o necesita más ayuda, Por favor, no dude en preguntarnos. Estamos felices de brindar apoyo y respuestas.
