Desarrollo de la tecnología de PCR
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos de ADN específicos.
- Se puede considerar un tipo especial de replicación de ADN que ocurre fuera de los organismos vivos.
- ADN polimerasa I fui descubierta por primera vez en 1955.
- El fragmento de Klenow de E. coli, descubierto a principios de la década de 1970 por el Dr.. h. Klenow, tiene valor experimental y practicidad.
- Sin embargo, Esta enzima no es resistente al calor y se denuncia a altas temperaturas, haciéndolo inadecuado para su uso en PCR que requiere desnaturalización de alta temperatura.
- La enzima comúnmente utilizada hoy, referido como polimerasa taq, fue aislado de la bacteria térmica acuaticus en 1976.
- Su característica de la resistencia al calor lo convierte en una enzima ideal, Pero su uso generalizado se produjo después de la década de 1980.
- El concepto original de PCR, Similar a la replicación de reparación de genes, fue propuesto por el Dr.. Kjell Kleppe en 1971.
- Publicó el primer experimento de replicación de genes puro y transitorio (Similar a los dos primeros ciclos de PCR).
- La PCR desarrollada hoy fue pionera por el Dr.. Kary B. Mules en 1983, Cuando Mullis trabajó para la empresa PE, Darle a la compañía una posición especial en el campo de PCR.
- Mullis y Saiki publicaron formalmente el primer artículo relacionado en 1985.
- Desde entonces, La aplicación de PCR se ha expandido rápidamente, y la calidad de los documentos relacionados ha superado muchos otros métodos de investigación.
- Después, La tecnología de PCR se ha utilizado ampliamente en investigación biológica y aplicaciones clínicas, convertirse en una técnica crucial en la investigación de biología molecular.
- Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993 por su contribución.
El principio de PCR
El principio básico de la tecnología PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad depende de los cebadores oligonucleótidos que son complementarios a la secuencia objetivo en ambos extremos. PCR consta de tres pasos de reacción básicos: desnaturalización, recocido, y extensión:
- Desnaturalización de la plantilla ADN: Después de calentar el ADN de la plantilla a alrededor de 93 ° C durante un cierto período de tiempo, El ADN de doble cadena del ADN de la plantilla o el ADN de doble cadena formado por amplificación por PCR se disocia, haciéndolo monocatenario para que pueda unirse a los cebadores y prepararse para la próxima ronda de reacción.
- Recocido (reasociación) de plantilla ADN y cebadores: Después de la plantilla, el ADN se desnaturaliza en hilos individuales, La temperatura se reduce a alrededor de 55 ° C, y las secuencias complementarias de los cebadores y la plantilla monocatenaria ADN se emparejan y se unen.
- Extensión de cebadores: Con la acción de la ADN polimerasa Taq, Usando DNTPS como sustratos de reacción y la secuencia objetivo como plantilla, De acuerdo con el principio de emparejamiento de bases complementarias y replicación semi-conservadora, Se sintetiza una nueva cadena de replicación semi-conservadora complementaria a la cadena de ADN de la plantilla. Esta cadena se puede amplificar en millones de copias del gen objetivo dentro de 2 a 3 horas repitiendo la desnaturalización, recocido, y procesos de extensión.
Sistema de reacción de PCR y condiciones de reacción Sistema de reacción de PCR estándar
| Componente | Volumen/concentración |
|---|---|
| 10X amortiguador de amplificación | 10µl |
| 4 tipos de mezcla DNTP | 200µl |
| Imprimaciones | 10-100µl |
| Plantilla ADN | 0.1-2µg |
| ADN polimerasa taq | 2.5µl |
| Mg2+ | 1.5mmol/L |
| Agua doble o triple destilada | 100µl |
Los cinco elementos de la reacción de PCR:
- Imprimaciones (Los cebadores de PCR son fragmentos de ADN, mientras que los cebadores para la replicación del ADN celular son cadenas de ARN)
- Enzima
- dNTP
- Plantilla
- Solución de amortiguación (que requiere mg2+)
El proceso de PCR estándar consta de tres pasos:
- Desnaturalización del ADN (90° C-96 ° C): Bajo la influencia del calor, Los enlaces de hidrógeno en la ruptura de la plantilla de ADN de doble cadena, Formando ADN monocatenario.
- Recocido (25° C-65 ° C): La temperatura del sistema disminuye, permitiendo que los cebadores se unan a la plantilla de ADN, Formando regiones locales de doble cadena.
- Extensión (70° C-75 ° C): Con la acción de la polimerasa Taq (Actividad óptima alrededor de 72 ° C), Usar dntps como sustratos, La extensión ocurre de los 5′ finalizar a los 3′ Fin de la imprimación, Sintetizando un hilo de ADN complementario a la plantilla.
Notas:
- Cada ciclo sufre desnaturalización, recocido, y extensión, duplicando la cantidad de ADN.
- Algunos protocolos de PCR, Debido a la corta región de amplificación, puede completar la replicación incluso si la actividad de la polimerasa Taq no es óptima.
- En estos casos, Se puede utilizar un método de dos pasos, donde el recocido y la extensión ocurren simultáneamente a una temperatura entre 60 ° C y 65 ° C, reduciendo el número de ciclos de temperatura y, por lo tanto, mejorando la velocidad de reacción.
Características de reacción de PCR
Fuerte especificidad
La especificidad de la reacción de PCR está determinada por:
- Unión específica y correcta de los cebadores al ADN de la plantilla.
- Principios de emparejamiento de bases.
- Fidelidad de la reacción de síntesis de ADN polimerasa Taq.
- Especificidad y conservación del gen objetivo.
Notas:
- La unión correcta de los cebadores a la plantilla es crucial.
- La unión de los cebadores a la plantilla y la extensión de las cadenas de cebadores siguen los principios del emparejamiento de bases.
- La fidelidad de la reacción de síntesis de polimerasa y la resistencia al calor de la ADN polimerasa Taq permiten el recocido (reasociación) de la plantilla y los cebadores que se producen a temperaturas más altas, aumentando en gran medida la especificidad de la unión y el mantenimiento de un alto nivel de precisión para el segmento de genes objetivo amplificado.
- Además, seleccionando regiones de genes objetivo con alta especificidad y conservación, El nivel de especificidad aumenta aún más.
Alta sensibilidad
- La cantidad de producto de PCR aumenta exponencialmente, habilitando la amplificación de las cantidades de plantilla de inicio de los picogramas (PG = 10^-12) a microgramos (μg = 10^-6).
- Puede detectar una célula objetivo de un millón de células.
- En detección de virus, La sensibilidad de PCR puede alcanzar 3 RFU (Unidades de formación recombinantes), mientras que en la bacteriología, La tasa de detección mínima es 3 bacterias.
Simple y rápido
- Las reacciones de PCR usan ADN polimerasa de Taq resistente al calor.
- Una vez que se prepara la mezcla de reacción, desnaturalización, recocido, y las reacciones de extensión se llevan a cabo en un líquido de amplificación de ADN y un baño de agua, Por lo general, completando la reacción de amplificación en 2 a 4 horas.
- Los productos de amplificación generalmente se analizan por electroforesis, sin la necesidad de usar isótopos, minimizando así la contaminación radiactiva y facilitando la difusión.
Requisitos de baja pureza para especímenes
- No hay necesidad de aislar virus o bacterias o células de cultivo.; El ADN crudo y el ARN se pueden usar como plantillas de amplificación.
- Muestras clínicas como la sangre, fluidos corporales, esputo, cabello, células, y el tejido vivo se puede usar directamente para la detección de amplificación de ADN.
Solución de problemas de PCR
Falsos negativos
La ausencia de bandas de amplificación en las reacciones de PCR a menudo es causada por factores clave:
Plantilla preparación de ácido nucleico
- Contaminantes como proteínas en la plantilla, La presencia de inhibidores de la polimerasa Taq, eliminación incompleta de proteínas (especialmente histonas) del ADN cromosómico, pérdida excesiva durante la extracción de plantilla, o la inhalación de fenol puede contribuir al problema.
- La desnaturalización incompleta de los ácidos nucleicos de la plantilla también puede desempeñar un papel.
- Cuando las cualidades enzimas y de los imprimadores son buenas, y las bandas de amplificación no aparecen, Es probable que se deba a problemas de digestión o fallas en el proceso de extracción de ácido nucleico de plantilla.
- Se deben preparar soluciones de digestión efectivas y estables, y el procedimiento debe permanecer fijo.
Inactivación enzimática
Esto puede requerir reemplazar la enzima con una nueva o usar una combinación de enzimas antiguas y nuevas para analizar si la pérdida de actividad enzimática o la insuficiencia conduce a falsos negativos. A veces, Olvidar por agregar polimerasa Taq o bromuro de etidio también puede causar problemas.
Problemas de imprimación
- Calidad y concentración de cebadores, simetría de las concentraciones de cebador, y las variaciones por lotes en la calidad de síntesis de cebadores pueden afectar los resultados de PCR.
- Las soluciones incluyen seleccionar unidades de síntesis de cebadores de buena reputación, Confirmación de concentraciones de cebadores a través de la electroforesis en gel de agarosa, Asegurar intensidades de banda similares para ambos cebadores, almacenar cebadores a altas concentraciones en alícuotas pequeñas para evitar la degradación, y garantizar el diseño racional de la imprimación para prevenir problemas como la formación de dímeros del cebador.
Concentración de Mg2+
La concentración de iones Mg2+ afecta significativamente la eficiencia de la amplificación de PCR. Las concentraciones excesivas o inadecuadas pueden afectar la especificidad o el rendimiento, conduciendo a una amplificación fallida.
Cambios de volumen de reacción
Los volúmenes de PCR generalmente varían de 20 μl a 100 μl, Dependiendo del propósito. Cambiar volúmenes debe ajustarse cuidadosamente para evitar fallas.
Factores físicos
La desnaturalización es crucial, y las temperaturas inadecuadas de desnaturalización o recocido pueden causar falsos negativos. El uso de termómetros estándar para verificar las temperaturas del termociclador o el baño de agua puede ayudar a prevenir fallas.
Variaciones de secuencia objetivo
Las mutaciones o deleciones en la secuencia objetivo pueden afectar la unión de la plantilla del cebador, conduciendo a una amplificación fallida.
Falsos positivos
Las bandas de amplificación de PCR observadas coinciden con las bandas de secuencia de destino, a veces aparece más uniforme y más brillante. Causas posibles:
Diseño de imprimación inapropiado:
La selección de secuencias de amplificación con secuencias de homología a no objetivo puede dar lugar a productos de amplificación no específicos durante la PCR. Las secuencias o cebadores objetivo cortos pueden conducir a falsos positivos. Es necesario rediseñar los cebadores.
Contaminación cruzada de secuencias objetivo o productos de amplificación:
Causas de contaminación:
- La contaminación de todo el genoma o segmentos grandes puede conducir a falsos positivos.
- La contaminación de fragmentos de ácido nucleico pequeños en el aire también puede causar falsos positivos.
Cómo manejar esta situación
1. Prácticas de laboratorio estrictas:
- Maneje muestras con cuidado para evitar la inhalación de secuencias objetivo en pipetas o salpicando fuera de los tubos de centrífuga.
- Autoclave todos los reactivos y equipos, a excepción de las enzimas y los materiales intolerantes a las altas temperaturas.
- Use tubos de centrífuga desechables y consejos de pipeta para minimizar la contaminación.
2. Exposición a los rayos UV:
- Exponer tubos de reacción y reactivos a la luz ultravioleta antes de la adición de la muestra para destruir los ácidos nucleicos existentes.
- Consideración de diseño de imprimación:
- Diseñe los cebadores cuidadosamente para minimizar el potencial de reactividad cruzada con secuencias no objetivo.
- Métodos de PCR anidados:
- Implementar métodos de PCR anidados para mitigar o eliminar falsos positivos causados por la contaminación de pequeños fragmentos de ácido nucleico en el aire.
Apariencia de bandas de amplificación no específicas
- Después de la amplificación por PCR, Las bandas aparecen que son inconsistentes en tamaño con las esperadas, ya sea más grande o más pequeño, o las bandas específicas y no específicas aparecen simultáneamente.
- Las razones de la aparición de bandas no específicas son:
- Complementariedad incompleta entre los cebadores y las secuencias objetivo, o formación de dímero de imprimación.
- Concentración excesiva de iones Mg2+, Temperatura de recocido demasiado baja, y número excesivo de ciclo de PCR.
- Calidad y cantidad de la enzima, con enzimas de algunas fuentes propensas a bandas no específicas, Mientras que otros no son.
- La cantidad enzimática excesiva a veces puede conducir a una amplificación no específica.
- Las contramedidas incluyen:
- Rediseñando cebadores si es necesario.
- Reducir la cantidad de enzimas o cambiar a enzimas de diferentes fuentes.
- Disminuir la concentración de imprimación, Aumento de la concentración de la plantilla adecuadamente, y reduciendo el número de ciclos.
- Elevar la temperatura de recocido de manera adecuada o adoptar un método de punto de dos temperaturas (desnaturalización a 93 ° C, recocido y extensión a alrededor de 65 ° C).
Apariencia de bandas de manchas o rayas
La amplificación por PCR a veces resulta en bandas de manchas o rayas.
- Esto a menudo es causado por una cantidad enzimática excesiva o una mala calidad de enzimas, Alta concentración de DNTP, concentración excesiva de Mg2+, baja temperatura de recocido, o número de ciclo excesivo.
- Las contramedidas incluyen:
- Reducir la cantidad de enzimas o cambiar a enzimas de diferentes fuentes.
- Disminución de la concentración de DNTP.
- Bajando adecuadamente la concentración de Mg2+.
- Aumento de la cantidad de plantilla.
- Reducción del número de ciclo.
