Introducción de PCR situ
En investigación científica, El establecimiento de cada nueva tecnología produce una serie de nuevos hallazgos de investigación, avanzando así varias disciplinas. En el campo de la investigación morfológica, La introducción del microscopio electrónico en la década de 1950 trajo estudios detallados desde el nivel celular hasta el nivel subcelular.
En las décadas de 1960 y 1970, La aplicación generalizada de las tecnologías de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica empujó las observaciones de estructuras subcelulares al nivel molecular de proteínas, permitiendo la localización de numerosas sustancias activas dentro de las células o niveles subcelulares. Esto tuvo un profundo impacto en el desarrollo de la biología médica..
La década de 1970 vio la extensa aplicación de técnicas de biología molecular en morfología, y con el advenimiento de la hibridación in situ, Se pueden localizar secuencias específicas de ADN o ARN dentro de los tejidos y las células. Estas observaciones avanzadas desde el nivel de proteína hasta el nivel de genes, profundizar así la comprensión humana de muchos fenómenos de la vida a nivel genético.
En la década de 1980, una técnica poderosa en el campo de la biología molecular, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), fue introducido. Fue adoptado rápidamente en estudios morfológicos, Permitir la localización y observación de ADN o ADN o ARN de baja copia o copia única dentro de las células. El advenimiento de esta tecnología promete traer más hallazgos de investigación., Tomar los estudios morfológicos un paso significativo adelante.
Principios fundamentales
El principio básico de la tecnología de PCR in situ es combinar la amplificación de alta eficiencia de la tecnología de PCR con la localización celular de la hibridación in situ. Esto permite la detección in situ de secuencias específicas de ADN o ADN o ARN de una sola copia dentro de las células de tejido.
La tecnología de PCR amplifica secuencias objetivo específicas guiadas por cebadores a través de ciclos de desnaturalización, recocido, y extensión del cebador bajo la acción de la ADN polimerasa. Las secuencias objetivo amplificadas (Por lo general, se puede amplificar por 10^6 veces) se muestran fácilmente a través de la electroforesis en gel o la hibridación de transferencia Southern. Por lo tanto, La tecnología de PCR es altamente sensible y específica, y con la automatización y estabilidad del ciclo térmico, se vuelve fácil de operar. Sin embargo, La PCR se realiza en una fase líquida, Requerir la interrupción celular para extraer ácidos nucleicos como plantillas antes de la amplificación. Esto hace que sea difícil correlacionar los resultados de la PCR con la estructura morfológica de las células del tejido y determinar el tipo de célula que contiene la secuencia objetivo específica.
La tecnología de PCR in situ combina con éxito PCR e hibridación in situ, retener las ventajas de ambos mientras compensan sus respectivas deficiencias. Las muestras para PCR in situ generalmente se fijan químicamente para mantener buenas estructuras morfológicas de las células de tejido. Tanto las membranas celulares como las membranas nucleares tienen cierta permeabilidad, Permitir componentes como cebadores, ADN polimerasa, y nucleótidos para ingresar a las células o núcleos durante la amplificación de PCR. El ARN o ADN intracelular o intranuclear fijo sirve como plantillas para la amplificación in situ. Los productos amplificados son generalmente moléculas grandes o se entrelazan entre sí, Lo que les dificulta difundir a través de la membrana celular o dentro de la membrana, así siendo retenido in situ. Por aquí, Las secuencias originales de ADN o ADN específicos o ADN específicos intracelulares o de ADN específico de una sola copia se amplifican exponencialmente in situ, y los productos amplificados pueden detectarse fácilmente mediante técnicas de hibridación in situ.
Tipos básicos
Basado en si los nucleótidos o cebadores utilizados en la reacción de amplificación están marcados, La tecnología de PCR in situ se puede dividir en dos categorías principales: métodos directos e indirectos. Además, Existe la tecnología de PCR de transcripción inversa in situ.
Tecnología de PCR directa in situ
En tecnología de PCR directa in situ, El producto amplificado lleva directamente una molécula etiquetada, es decir., Uso de fragmentos de trifosfato o cebador de adenosina etiquetados. Cuando el espécimen se somete a la amplificación por PCR, Las moléculas etiquetadas se incorporan al producto amplificado, mostrando los marcadores, Hacer que el ADN o ARN específico sea visible en la muestra (in situ).
Los marcadores comunes incluyen el isótopo radiactivo ", biotina, y digoxigenina. Estos marcadores’ Las posiciones se visualizan utilizando autorradiografía, histoquímica de afinidad, o métodos de inmunohistoquímica.
Ventajas:
- Operación simple
- Proceso corto
- Ahorrador
Desventajas:
- Menor especificidad
- Propenso a falsos positivos
- Eficiencia de amplificación más baja, especialmente en las secciones de parafina
Estas desventajas son prominentes en las secciones de parafina debido al posible daño del ADN durante el procesamiento (fijación, deshidración, incrustación). El ADN dañado se puede reparar utilizando los nucleótidos marcados, conduciendo a falsos positivos. El uso de cebadores etiquetados en PCR directo in situ reduce aún más la eficiencia de la amplificación.
Tecnología de PCR indirecta in situ
La tecnología de PCR indirecta in situ implica la amplificación de ADN o ARN específico dentro de las células, seguido de hibridación in situ con sondas marcadas, mejorando significativamente la especificidad. Este método es actualmente la tecnología de PCR in situ más utilizada más ampliamente..
Diferencias del método directo:
- El sistema de reacción es el mismo que la PCR convencional
- No se usan etiquetas en cebadores o trifosfato de adenosina
En PCR indirecto in situ, La amplificación se logra primero, seguido de la detección de los productos de ADN específicos amplificados utilizando técnicas de hibridación in situ. Este método también se conoce como hibridación de PCR in situ (Bateador).
Ventajas:
- Mayor especificidad
- Mayor eficiencia de amplificación
Desventajas:
- Pasos de operación más complejos en comparación con el método directo
Tecnología de PCR de transcripción inversa in situ
PCR de transcripción inversa in situ (RT-PCR in situ) es una nueva tecnología que aplica técnicas de RT-PCR en fase líquida a las muestras de células de tejido. A diferencia de RT-PCR (fase líquida), Antes de realizar PCR de transcripción inversa in situ, Las muestras de tejido se tratan con DNasa para destruir cualquier ADN presente en el tejido, Asegurar que la plantilla para la amplificación se sintetice ADNc del ARNm, no el ADN original en la célula. Los otros pasos básicos son similares a la RT-PCR de fase líquida.
Pasos básicos
Los pasos básicos de la tecnología de PCR in situ incluyen la preparación de muestras, Amplificación in situ (PCR), y detección in situ. Los pasos se detallan a continuación, con un enfoque en las secciones de parafina como ejemplo.
Preparación de muestras
La tecnología de PCR in situ se puede aplicar a las suspensiones celulares, manchas celulares, secciones congeladas, y secciones de parafina. En comparación con otros métodos, realizar PCR in situ en células intactas suspendidas produce los mejores resultados, mientras que las secciones de parafina producen lo peor. A pesar de esto, Los avances recientes han informado una eficiencia de PCR satisfactoria en las secciones de parafina.
Desafíos:
- Mala conducción térmica y convección de calor desigual en toboganes
- Adsorción de ADN polimerasa Taq por diapositivas de vidrio
- Falta de membranas citoplasmáticas o nucleares intactas que conducen a productos de amplificación difusos
Fijación:
- Formalina o fijación de paraformaldehído (10% formalina amortiguada o 4% paraformaldehído) Funciona bien para PCR in situ
- Tiempo de fijación óptimo: 4-6 horas a 4 ° C
Espesor de sección:
- Las secciones más gruesas producen mejores resultados debido al mayor contenido de ADN objetivo y más estructuras de membrana, Prevención de la difusión del producto. Sin embargo, Las secciones más gruesas pueden reducir la calidad y resolución de la observación morfológica.
Tratamiento de diapositivas:
- Evite el desprendimiento de los tejidos durante la PCR y la hibridación in situ tratando los portaobjetos con poli-L-lisina o silanización.
Digestión de proteinasa
Antes de amplificación in situ, Las muestras de tejido necesitan tratamiento con proteinasa. La digestión de la proteinasa aumenta la permeabilidad celular, Permitir que los componentes de reacción ingresen a las células y expongan secuencias objetivo para la amplificación. Las proteinasas de uso común incluyen la proteinasa K, tripsina, o Pepsin. El alcance de la digestión debe ajustarse en función de la fijación del tejido. Después de la digestión, Asegure la inactivación de la enzima mediante el calentamiento o el lavado completo, ya que las enzimas residuales pueden destruir la ADN polimerasa Taq en la reacción de PCR.
Pros y contras:
- La digestión aumenta la permeabilidad, Ayudando a reacciones posteriores
- También puede aumentar las posibilidades de difusión del producto, conduciendo a falsos positivos o negativos.
Amplificación in situ (PCR)
La amplificación in situ se refiere a realizar la reacción de PCR directamente sobre muestras de células de tejido. Su principio básico es completamente el mismo que el de la PCR de fase líquida.
Imprimaciones
Los cebadores utilizados en PCR son típicamente 15-30 pares de bases (pb) de longitud, y los fragmentos amplificados son sobre 100-1000 pb. Los cebadores más cortos son preferibles para PCR in situ. El ADN extraído de las secciones de parafina rara vez se ha terminado 400 pb, y el ARN rara vez termina 200 pb. Las secuencias más largas son más propensas a los desajustes entre cebadores y plantillas., conduciendo a reacciones no específicas.
Sistema de reacción
El sistema de reacción para PCR in situ es fundamentalmente similar a la PCR de fase líquida convencional. Sin embargo, ya que se realiza en secciones de tejido fijo, Para lograr mejores resultados de amplificación, se sugiere que las concentraciones de cebadores, ADN polimerasa taq, y Mg²⁺ en el sistema de reacción debe ser más alto que los de la PCR de fase líquida. Albúmina de suero bovino (BSA) debe agregarse al sistema de reacción para evitar la unión de la ADN polimerasa Taq al portaobjetos de vidrio, que podría reducir la eficiencia de la amplificación.
Ciclismo térmico
El ciclo térmico para PCR in situ se puede realizar en un ciclador térmico especializado, que es simple de operar. También se puede hacer en un ciclador térmico de PCR general cubriendo la plataforma de muestra con una capa de papel de aluminio para crear una plataforma, llenar el espacio en la plataforma de muestra con aceite mineral o agua, y colocar las diapositivas en la plataforma para llevar a cabo los pasos de ciclismo térmico.
Para garantizar una amplificación suficiente, La duración de cada paso en el proceso de ciclo térmico para la PCR in situ puede ser ligeramente más larga que la de la PCR convencional. Además, El método de inicio en caliente se puede emplear, donde el portaobjetos se calienta a 80-94 ° C antes de agregar inmediatamente la ADN polimerasa.
Para minimizar la pérdida del sistema de reacción durante el proceso de ciclo térmico, esmalte de uñas claro, aceite mineral, o se puede usar una bolígrafo para sellar los bordes del deslizamiento de la cubierta.
Lavado
Después de la amplificación in situ, La muestra debe lavarse para eliminar los productos amplificados que se han difundido fuera de las celdas. El lavado insuficiente puede dar lugar a productos amplificados visibles durante la detección, causando un alto fondo o resultados falsos positivos. Sin embargo, El lavado excesivo también puede eluir los productos amplificados dentro de las células, debilitar o perder la señal positiva.
Algunos autores recomiendan después de la fijación con 4% paraformaldehído para 2 horas o 2% glutaraldehído para 5 minutos después de la amplificación para retener los productos amplificados dentro de las células durante la detección, Mejorar la sensibilidad y la especificidad.
Detección in situ
El método de detección de productos de amplificación por PCR in situ depende del diseño de PCR in situ. El método directo implica la detección in situ directa basada en la naturaleza de las moléculas marcadas. El método indirecto requiere hibridación in situ para la detección.
Detección marcada con fluoresceína, biotina, fosfatasa alcalina, o la peroxidasa de rábano picante sigue los mismos principios que las técnicas de histoquímica de inmunohistoquímica y afinidad.
Aplicaciones de la tecnología de PCR in situ
La ventaja significativa de la tecnología de PCR in situ es su capacidad para detectar secuencias de genes específicas con bajos números de copias directamente dentro de las células de tejido. Dependiendo de la naturaleza del gen que se está probando, Las aplicaciones de PCR in situ se pueden dividir en la detección de genes exógenos y endógenos.
1. Detección de genes exógenos
(1) Detección de genes virales
Las células infectadas con virus a menudo carecen de métodos de detección efectivos. Sin embargo, con la aplicación de la tecnología de PCR in situ, Este problema desafiante tiene una solución prometedora. Detectar varios virus como el VIH, VPH, HSV, VHB, y el VHC nos permite observar estos virus’ Roles en el SIDA, Tumores del sistema reproductivo, hepatitis, y cáncer de hígado e identificar de inmediato a las poblaciones infectadas.
(2) Detección de genes bacterianos
La aplicación más destacada está en la detección de Mycobacterium tuberculosis. Cuando las lesiones de tuberculosis son atípicas, Es difícil encontrar Mycobacterium tuberculosis bajo el microscopio utilizando métodos de tinción especiales. La tecnología de PCR in situ puede ayudar a hacer un diagnóstico definitivo, Incluso cuando Mycobacterium tuberculosis es escasa.
(3) Detección de genes introducidos
En investigación animal transgénica, confirmando si se ha introducido un gen, y en pacientes que reciben terapia génica, verificar si el gen introducido está presente, Se puede lograr con la tecnología de PCR in situ. De este modo, La PCR in situ se ha convertido en un método de detección importante.
2. Detección de genes endógenos
(1) Detección de genes anormales
La tecnología de PCR in situ puede detectar mutaciones genéticas y reordenamientos dentro del cuerpo, tales como mutaciones de genes de protooncogen y supresores de tumores, y reordenamientos de genes de cadena pesada de inmunoglobulina en linfomas malignos. Esto ofrece amplias perspectivas de aplicación para la investigación y el diagnóstico de tumores.
(2) Detección de genes intrínsecos
Para genes intrínsecos bajos en las células del cuerpo con solo una o unas pocas copias, La tecnología de hibridación in situ es ineficaz debido al bajo número de copias de genes. Mientras que la PCR de fase líquida puede amplificar y detectar estos genes, no puede determinar el tipo de célula que contiene el gen. La tecnología de PCR in situ supera las limitaciones de estas dos técnicas, Permitiéndonos detectar varios genes humanos y completar el mapa de genes humanos.
Hibridación in situ por fluorescencia (PEZ)
La hibridación de fluorescencia in situ es un método de mapeo físico que utiliza sondas marcadas con fluorescencia para detectar la hibridación entre la sonda y los cromosomas en metafase o cromatina a interfase.
Desarrollado a fines de la década de 1980, Los peces evolucionaron de la tecnología de hibridación radiactiva in situ a una técnica citogenética molecular no radioactiva reemplazando el marcado de isótopos con marcado de fluorescencia. En pescado, La sonda se combina primero con una molécula reportera, que luego se vincula a un tinte fluorescente a través de un proceso inmunocitoquímico después de la hibridación.
El principio básico del pez es etiquetar el ADN (o ARN) sondas con moléculas de nucleótidos especiales, Hibridice estas sondas directamente a cromosomas o secciones de fibra de ADN, y use anticuerpos monoclonales junto con moléculas fluorescentes para unirse específicamente a las moléculas de sonda. Esto permite la cualitativa, posicional, y análisis cuantitativo relativo de secuencias de ADN en cromosomas o secciones de fibra de ADN.
El pescado ofrece seguridad, velocidad, alta sensibilidad, Preservación de la sonda a largo plazo, y la capacidad de mostrar simultáneamente múltiples colores. Puede mostrar tanto los cromosomas metafase como los núcleos interfase. Además, La hibridación in situ de fluorescencia multicolor y las técnicas de hibridación in situ de fluorescencia in situ.
Para rRNA hibridación de fluorescencia in situ, Varios factores pueden conducir a una baja intensidad de señal de fluorescencia:
- Contenido de ribosoma bajo celular
- Permeabilidad de membrana de células bajas
- Accesibilidad de secuencia de objetivo bajo debido al plegamiento de ARNr, donde algunas posiciones están bien unidas con otras cadenas o proteínas, evitar que la sonda se hibriden con la secuencia objetivo.
Para probar si la secuencia objetivo en las células se hibride fácilmente por la sonda y determinar la temperatura de hibridación óptima, “pez clon” se puede usar: Los genes rRNA se incorporan a los plásmidos, expresado en E. coli para formar ribosomas, y luego hibridado con sondas marcadas con fluorescencia.
Los peces también se pueden combinar con citometría de flujo para contar o aislar células marcadas con fluorescencia.
