Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Procedimiento de experimento para estudiantes

I. Objetivo

Aprenda y domine los principios básicos y los métodos de detección del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. (RFLP) marcadores genéticos.

II. Principio

La primera generación de marcadores genéticos moleculares., RFLP, Se basa en mutaciones en los sitios de corte de las enzimas de restricción en los genomas de diferentes variedades. (individuos). Estas mutaciones pueden incluir cambios de base., inserciones, eliminaciones, o reordenamientos entre los sitios de corte de enzimas, lo que lleva a variaciones en el tamaño de los fragmentos. Estas variaciones se pueden detectar mediante PCR, digestión con enzimas de restricción, y electroforesis en gel de agarosa, permitiendo la comparación de diferencias en el nivel de ADN (es decir., polimorfismo) entre diferentes variedades (individuos). RFLP se ha utilizado ampliamente en la construcción de mapas genéticos genómicos., localización de genes, evolución biológica y clasificación, y estudios de diversidad genética.

III. Instrumentos, Materiales, y reactivos

Instrumentos:

• Baño María eléctrico a temperatura constante.
• Sistema de detección y electroforesis en gel de agarosa.

Materiales y reactivos:

• Enzima de restricción Hind III
• 10×M Búfer
• Producto de PCR a analizar
• Marcador de ADN DL2000
• 6×Cargando buffer
• Agua bidestilada estéril
• 1.5% gel de agarosa (Nota: Contiene bromuro de etidio (EB), que es cancerigeno; manejar con guantes)
• 0.5% TBE (tampón de electroforesis)

IV. Procedimiento

1. Digestión con enzimas de restricción Hind III

   • Volumen de reacción: 10 µL en un 0.2 Tubo Eppendorf de ml
   • Agregue lo siguiente en orden:
     • 10×M Búfer: 1 µL
     • ddH2O: 5.5 µL
     • trasero III: 0.5 µL
     • producto de PCR: 3 µL
   • Digerir a 37 ℃ en un baño de agua durante 2 horas. Utilice todo el producto de digestión para la detección del gel de agarosa..

2. Electroforesis en gel de agarosa

   • Prepara un 1.5% gel de agarosa.
   • Mezcla 10 μL del producto de digestión con 1 μL de tampón de carga.
   • Realizar electroforesis a un voltaje constante de 180V..
   • El ADN lleva una carga negativa., por lo que migrará del electrodo negativo al positivo durante la electroforesis.
   • Detenga la electroforesis cuando el ADN haya migrado a 1/2 a 2/3 de la longitud del gel. Observar bajo un detector UV..

V. Asignación

Escribe el procedimiento detallado de este experimento y describe los resultados que observaste. (incluyendo dibujos).