Especificación
ADN polimerasa taq 1000 U con búfer mixto (Envío con bolsa de hielo)
Almacenamiento Condiciones:
Taq DNA polimerasa y taq PCR Los kits deben almacenarse en -30 a -15 ° C en un congelador de temperatura constante al recibir.
Prueba:
Notas antes de comenzar:
- Provisto de tampón de PCR de carga que contiene reactivo de carga de gel y tintes de seguimiento de gel.
- El tampón de PCR y el tampón de PCR de carga producen una concentración final de 1.5 mm mgcl2 en la mezcla de reacción. Ajuste la concentración de Mg2+ si es necesario agregar 25 MM MGCL2.
- Mezcla DNTP de alta calidad de PCR (10 milímetro) está disponible por separado si es necesario.
- Mantenga los tubos de PCR en hielo hasta que se coloque en el ciclador térmico.
- Incluir un control sin plantilla (NTC) En cada ensayo.
Preparación y mezclar:
- Buffers y reactivos de descongelación a temperatura ambiente o en hielo, Luego manténgalos en el hielo después de descongelar completo.
- Prepare una mezcla de reacción que contenga todos los componentes de PCR excepto la plantilla ADN. Preparar 10% Más volumen del requerido.
- Mezcle la reacción Mezcle bien y la prescinte en tubos de PCR.
- Agregar ADN de plantilla (≤1 µg/reacción) a tubos de PCR. Para RT-PCR, Agregue una alícuota de la reacción de transcriptasa inversa, no excediendo 10% del volumen final de PCR.
Configuración de reacción utilizando la ADN polimerasa de Seno Taq
| Componente | Volumen/reacción | Concentración final |
| Mezcla de reacción | ||
| 10x búfer de PCRˢ¹ o | 10 l | 1X |
| 10x Cargar búfer de PCR(opcional) | ||
| mezcla dntp (10 mm de cada) | 2 l | 200 µm de cada dNTP |
| Cebador1 | Variable | 0.1–0.5 µm |
| Cebador2 | Variable | 0.1–0.5 µm |
| ADN polimerasa taq | 0.5 l | 2.5 unidades/reacción |
| Agua sin rnase | Variable | |
| Plantilla ADN (agregado a paso 4) | Variable | ≤1 µg/reacción |
| Volumen total de reacción | 100 µl² |
Térmico Ciclismo:
Programa Termal Cycler Según las instrucciones del fabricante. Consulte el programa de ciclismo proporcionado.
Condiciones de ciclismo optimizadas para la ADN polimerasa Taq
| Paso | Tiempo | Temperatura | Comentario |
|---|---|---|---|
| Desnaturalización inicial | 3 mín. | 94°C | |
| 3-ciclismo de paso: | |||
| Desnaturalización | 0.5–1 min | 94°C | |
| Recocido | 0.5–1 min | 50–68 ° C | Aproximadamente 5 ° C por debajo de TM de cebadores. |
| Extensión | 1 mín. | 72°C | Para productos de PCR más tiempo que 1 kb, Use un tiempo de extensión de aproximadamente 1 Min por KB ADN. |
| Número de ciclos | 25–35 | ||
| Extensión final | 10 mín. | 72°C |
Simplificado Comienzo caliente:
Iniciar programa PCR. Una vez que el ciclador térmico alcanza 94 ° C, Coloque los tubos de PCR en el ciclador para mejorar la especificidad.
Post-PCR:
- Después de la amplificación, Las muestras se pueden almacenar a 2–8 ° C durante la noche o a -20 ° C para un almacenamiento más largo.
- Los productos de PCR se pueden cargar directamente en gel de agarosa usando el amortiguación de PCR de carga sin la adición previa de tampón de carga y tintes de seguimiento de gel. Consulte la tabla proporcionada para la distancia de migración y los tintes de rastreo de gel.
Distancia de migración de los tintes de rastreo de gel en el búfer PCR de carga
| % Tae (TBE) agarosa gel | Tinte rojo | Tinte naranja |
| 0.8 | 500 (270) pb | ~ 80 (<10) pb |
| 1.0 | 300 (220) pb | ~40 (<10) pb |
| 1.5 | 250 (120) pb | ~20 (<10) pb |
| 2.0 | 100 (110) pb | <10 (<10) pb |
| 3.0 | 50 (100) pb | <10 (<10) pb |
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