Kit de extracción de ARN súper puro (TRIzol)

1. Componentes del kit de reactivos

Especificaciones	50t	100t
Gato. No.	SN0303	SN0304
Columnas de extracción de ARN (colocar)	50 (colocar)	100 (colocar)
ADNasa I	1ml	1ml
10 × Tampón de reacción	1 ml	2 ×1ml
Tampón Trizol	50 ml	2 × 50 ml
Tampón de eliminación de inhibidores	30 ml	2 × 30 ml
Tampón de lavado 1	15 ml	2 × 15 ml
Tampón de elución	20 ml	2 ×20ml
Manual de instrucciones	1	1

 

2. Almacenamiento

Este kit de reactivos debe almacenarse a temperatura ambiente. (15-25℃) en un ambiente seco y es estable durante 12 meses. La ADNasa I contiene un conservante., permitiendo el transporte a temperatura ambiente, pero para almacenamiento a largo plazo, debe mantenerse a -20 ℃.

3. Instrucciones para usar el kit de reactivos

3.1 Este kit está destinado a fines de investigación de biología molecular y no debe utilizarse para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades..

3.2 Algunos componentes del kit contienen irritantes.; es recomendable tomar las precauciones necesarias (como usar ropa y gafas protectoras).

3.3 El uso de este kit requiere equipo adicional como una centrífuga de alta velocidad., baño de agua (baño de metal), mezclador Vortex, etanol anhidro, nitrógeno líquido, cloroformo, agua desionizada estéril, y tubos EP.

4. Introducción al kit de reactivos

Este kit de purificación de ARN utiliza el TRIzol tradicional combinado con el método de membrana de columna para la purificación rápida de plantas., animal, tejido, celúla, ARN microbiano, y ARN de hifas de hongos. Es adecuado para la mayoría de especies.. Este kit de purificación de ARN se puede aplicar a tejidos vegetales que superen 100 mg. El ARN extraído con este kit tiene un contenido de ADN extremadamente bajo.. Si la sensibilidad al ADN en los experimentos es una preocupación, se recomienda utilizar digestión con DNasa I en la columna.

El kit de purificación rápida de ARN puede extraer ARN total de muestras (Incluyendo ARN nuclear y ARN citoplasmático.) dentro 1 hora. El ARN extraído se puede utilizar directamente para RT-PCR, transferencia Northern, y otras aplicaciones.

5. Principios y procedimientos experimentales

6. Proceso de extracción

Precauciones antes de comenzar el experimento.:

A. Antes de usar, agregue la cantidad especificada de etanol absoluto a LavarBuffer 1 según la etiqueta en la botella de reactivo, y marque la casilla en la etiqueta para indicar que se ha agregado etanol absoluto.

B. El tampón de elución es un 0.1x solución TE que contiene un mínimo de EDTA. Si el EDTA afecta a experimentos posteriores, se recomienda reemplazar el tampón de elución con agua desionizada estéril.

1. Procesamiento de muestras:

A. Tejido: Si los materiales frescos no se pueden utilizar inmediatamente, colóquelos en nitrógeno líquido y guárdelos a -80°C. Los materiales secos se pueden almacenar a temperatura ambiente.. Moler 30~80 mg de tejido en nitrógeno líquido y agregar 1 ml de tampón Trizol para homogeneización.

B. Células cultivadas en monocapa: Aspirar el medio de cultivo y agregar. 1 ml de tampón Trizol para homogeneización.

C. Suspensión celular: Centrifugar para recolectar células y agregar. 1 ml de tampón Trizol para homogeneización.

2. Después de agregar Tampón trizol a la muestra, mezclar bien pipeteando, permitir la lisis completa de la muestra, e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.

3. Agregue cloroformo en una proporción de 200 µl por 1 ml de tampón Trizol, agitar vigorosamente durante 30 segundos, e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Centrifugar el lisado a 4°C., 12,000 rpm para 10 minutos. El ARN estará presente en la fase acuosa superior..

5. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga., evitando la colección de las capas media e inferior. (Nota: Aproximadamente 400 Se pueden transferir µl de líquido., que puede ser menor para algunas especies.)

6. Agregue un volumen igual de etanol absoluto preenfriado., mezclar rápidamente. (Por ejemplo, agregar 400 μl de lisado, agregar 400 µl de etanol absoluto. Si el volumen del lisado es menor que 400 µl, reducir proporcionalmente la cantidad de etanol absoluto. Puede formarse un ligero precipitado después de añadir etanol., pero no afecta los experimentos posteriores.)

7. Transferir el líquido obtenido a una columna de purificación de ARN. (aproximadamente 650-700 µl por vez), centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos recogidos, y vuelva a insertar el tubo de recolección en la columna de purificación para el siguiente paso.

8. Repita el paso 7, agregar el líquido restante a la columna de purificación de ARN, centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos y el tubo de recogida.

9. Coloque la columna de purificación de ARN en un tubo de recolección nuevo, agregar 300 µl de tampón de eliminación de inhibidores, centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos, y vuelva a insertar la columna de purificación de ARN en el tubo para el siguiente paso.

10. Agregar 80 µl de ADNasa Isolución de trabajo para la columna de purificación de ARN, incubar a 20°C a 30°C durante 15 minutos. (Prepare la solución de trabajo DNase I: 62 μl de agua libre de RNasa, 8 µl de tampón de reacción 10×, y 10 µl de ADNasa I, compensar hasta 80 µl de solución de trabajo de ADNasa I.)

11. Agregar 300 µl de tampón de eliminación de inhibidoresa la columna de purificación de ARN, centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto, desechar los residuos, y vuelva a insertar la columna de purificación de ARN en el tubo para el siguiente paso.

12. Agregar 700 μl de tampón de lavado 1a la columna de purificación de ARN, centrifugar en 14,000 rpm (20,000×g) para 2 minutos, extienda el tiempo de centrifugación si es necesario para una membrana más seca. (Nota: Confirmar la adición de etanol al tampón de lavado. 1; La presencia de etanol afecta significativamente a los experimentos posteriores.. Asegúrese de que la membrana esté seca después de la centrifugación antes de la elución.. Desechar los residuos y el tubo de recogida.. Después de usar el tampón de lavado 1, la membrana de la columna de purificación de ARN solo debe tener un ligero color. Retire con cuidado la columna de purificación de ARN después de la centrifugación., asegurándose de que no toque el tubo de recolección para evitar la contaminación con etanol.)

13. Coloque la columna de purificación de ARN en un tubo de centrífuga nuevo., goteo 100 μl de tampón de eluciónsobre la membrana, incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos (15°C a 25°C), y centrifugar a más de 8,000 rpm para 1 minuto. (Nota: Elución de ARN con 50 Los µl de tampón de elución pueden aumentar la concentración de ARN pero disminuir el rendimiento total de ARN.)

14. Repita el paso anterior. (Nota: Se puede usar un nuevo tubo de centrífuga para recolectar el ARN eluido la segunda vez o continuar usando el tubo de recolección original para recolectar el ARN..)