Kit de extracción de ADN genómico de heces o suelo

1. Componentes del kit de reactivos

2. Almacenamiento

Este kit de reactivos debe almacenarse a temperatura ambiente. (15-25℃) y en condiciones secas, con una vida útil de 12 meses. Las columnas de purificación y extracción de ADN se pueden almacenar durante 1 año en un ambiente fresco y seco. lisozima, Proteinasa K, y ARNasa A contienen conservantes, permitiendo el transporte a temperatura ambiente, pero para almacenamiento a largo plazo, deben mantenerse a -20 ℃.

3. Instrucciones para usar el kit de reactivos

3.1 Este kit de reactivos está destinado a la investigación de biología molecular y no debe utilizarse para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades..

3.2 Algunos componentes del kit de reactivos contienen irritantes.. Se recomiendan medidas de protección como el uso de ropa y gafas protectoras..

3.3 Durante el uso de este kit de reactivos, una centrífuga de alta velocidad, baño de agua (baño de metal), mezclador Vortex, etanol anhidro, agua desionizada estéril, y los tubos EP deben ser preparados por el usuario.

4. Introducción al kit de reactivos

Este kit proporciona un método rápido y eficiente para purificar el ADN genómico microbiano del suelo., heces, y muestras de vómito. Es ampliamente utilizado para la extracción de ADN microbiano del suelo., heces, y vomitar.

Este kit elimina eficazmente las impurezas y los inhibidores de la muestra., reducir las reacciones inhibidoras en experimentos posteriores, como PCR. Todo el proceso de purificación no requiere reactivos tóxicos como el fenol-cloroformo.. El ADN extraído se puede utilizar directamente para PCR., transferencia del sur, y otras aplicaciones.

5. Principios y procedimientos experimentales

6. Proceso de extracción

Antes de comenzar el experimento:

A. Tampón reactivo IV puede precipitar en condiciones de baja temperatura. Recomendamos calentar a las 65 ℃ para 5 minutos. Después del precipitado se disuelve, se puede utilizar normalmente.

B. Antes de usar, agregue la cantidad especificada de etanol anhidro a Tampón de lavado 1 Como se indica en la etiqueta de la botella. Marque una verificación de la etiqueta para indicar la adición de etanol anhidro.

C. El tampón de elución es un 0.1x solución TE que contiene cantidades mínimas de EDTA. Si el EDTA podría afectar experimentos posteriores, Es aconsejable sustituir el tampón de elución con agua desionizada estéril.

1. Procesamiento de muestras (Eliminación de inhibidores):

A. Muestras fecales y de vómitos: Agregue aproximadamente 200 mg de la muestra a extraer., agregar 1ml de reactivo de eliminación de ácidos húmicos I, agite bien para 1-2 minutos, centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos, descartar el sobrenadante, agregar 560µl de tampón IV a la bolita, invertir y mezclar bien, digerir a 85 ℃ durante 5 minutos, invertir y mezclar 6-7 momentos durante la digestión, luego proceda a paso 2.

B. Muestras de suelo: Pesa aproximadamente 0,1 g-0.5g de suelo tamizado, agregar 500µl de tampón IV y 100 µl de reactivo de eliminación de ácido húmico I, invertir y mezclar bien, digerir a 85 ℃ durante 5 minutos, invertir y mezclar 6-7 momentos durante la digestión, luego proceda a paso 2.

(Nota: Reactivo de eliminación de ácido húmico I/Reactivo de eliminación de ácido húmico II Se utiliza principalmente para suelos con alto contenido de ácidos húmicos., como suelos forestales y suelos sedimentarios. Agregar 1ml de reactivo de eliminación de ácidos húmicos I a la muestra, vórtice, agitar para 1-2 minutos, centrifugar en 8,000 rpm para 2 minutos, descartar el sobrenadante, Luego añade 1ml de reactivo de eliminación de ácidos húmicos II, vórtice, centrifugar en 8,000 rpm para 2 minutos, descartar el sobrenadante. Este paso puede reducir aún más los inhibidores de ácidos húmicos del suelo, pero reducir significativamente el rendimiento de ADN..)

2. Centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga (aproximadamente 500 μl de líquido transferido), añadir 20μl de proteinasa K (10 mg/ml), 20µl de lisozima, y 20 μl de ARNasa A, e incubar a 65 ℃ durante 2 minutos.
3. Agregue un volumen igual de Reactivo Tampón C plus (aproximadamente 560 μl de líquido transferido) al lisado, mezclar bien. Si aparece un precipitado blanco, deja que se asiente; No afectará a los experimentos posteriores después de que desaparezca el precipitado..
4. Agregue un volumen igual de etanol a Reactivo Tampón C plus (p.ej., agregar 560µl de Reactivo Tampón C plus, luego agregue 560μl de etanol), mezclar bien. Puede haber precipitaciones, pero no afectará los experimentos posteriores..
5. Añadir el líquido obtenido a la columna de purificación de extracción de ADN. (manga) (Aproximadamente 650-700 μl cada vez), centrifugar a más 8,000 rpm para 1 minuto, Deseche el líquido de desechos recolectados, y vuelva a insertar el tubo de recolección en la columna de purificación de extracción de ADN (manga) para el siguiente paso.
6. Agregar 400µl de tampón de eliminación de inhibidores, centrifugar a más 8,000 rpm para 1 minuto, Deseche el líquido de desechos, y reinsertar el purificación de ADN columna en la manga para el siguiente paso.
7. Agregar 500µl de tampón de lavado 1 a la columna de purificación de extracción de ADN (manga), centrifugar en 14,000 rpm (20,000×g) para 1 minuto.
8. Agregar 300µl de tampón de lavado 1 nuevamente a la columna de purificación de extracción de ADN (manga), centrifugar en 14,000 rpm (20,000×g) para 2 minutos.
9. Coloque la columna de purificación de extracción de ADN. (manga) en un nuevo tubo de centrífuga, abrir la tapa, e incubar a 65 ℃ durante 2 minutos. Este paso se puede ampliar si es necesario para evaporar el etanol tanto como sea posible para evitar que los residuos de etanol afecten los experimentos posteriores..
10. Goteo 100µl de tampón de elución sobre la membrana, centrifugar en 12,000 rpm para 2 minutos.

(Nota: 1. La elución de ADN con 50 μl de tampón de elución puede aumentar la concentración de ADN pero reducir el rendimiento total de ADN.; 2. El ADN eluido se puede volver a aplicar a la columna de purificación de extracción de ADN, centrifugar nuevamente a 12,000 rpm para 2 minutos, y recolectados para aumentar el rendimiento de ADN.)