Pirofosfato solarbio: Kit de ensayo de fructosa 6-fosfato-1 fosfotransferasa

Atributo	Detalles
Nota	Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba.
Instrumento de detección	espectrofotómetro
No gato	BC3400
Tamaño	50T/48S

Componentes:

Extraer solución: 55mililitros × 1, almacenado en 4 °C.

Reactivo 1: 40mililitros × 1, almacenado en 4 ° C y protegido de la luz.

Reactivo 2: Polvo × 1, almacenado en -20 ° C y protegido de la luz. Justo antes de usar, agregar 6 ml de agua destilada para disolver completamente. Los reactivos no utilizados se almacenan en -20 °C para 1 Semana después de dispensar los ciclos repetidos de congelación-descongelación.

Reactivo 3: polvo × 1, almacenado en -20 ° C y protegido de la luz. Justo antes de usar, agregar 6 ml de agua destilada para disolver completamente. Los reactivos no utilizados se almacenan en -20 ° C después de dispensar. Prohibición de los repetidos ciclos de congelación de descongelación.

Reactivo 4: 91µl × 2, almacenado en 4 ° C y protegido de la luz. Justo antes de usar, agregar 0.209 ml de agua destilada para disolver completamente. Almacenado en 4 °C para 1 semana.

Reactivo 5: Polvo × 2, almacenado en -20 ° C y protegido de la luz. Justo antes de usar, agregar 0.3 ml de agua destilada para disolver completamente. Los reactivos no utilizados se almacenan en -20 °C para 1 Semana después de dispensar.

Reactivo 6: 60 µl × 1, almacenado en 4 ° C y protegido de la luz. Justo antes de usar, agregar 0.6 ml de agua destilada para disolver completamente. Almacenado en 4 °C para 1 semana.

Descripción del Producto:

Pirofosfato: Fructosa-6-fosfato-1-fosfotransferasa (PFP, EC2.7.1.90) es una enzima citosólica que está ampliamente presente en los tejidos vegetales y cataliza la fosforilación de la fructosa-6-fosfato como la fosfofructoquinasa. Como resultado, La reacción catalítica de un solo PEP es una reacción reversible, y el pirofosfato se usa en lugar de ATP, que juega un papel importante en el metabolismo del carbono de la fotosíntesis.

PFP cataliza la conversión de fructosa 6-fosfato a fructosa 1,6-Difosfato, que se convierte en fosfato de dihidroxiacetona por la acción de la aldolasa y la fosfato triosa isomerasa, y luego catalizado por α-fosfato glicerol deshidrogenasa y NADH de glicerol 3-diifosfato y NAD. El cambio en la absorbancia en 340 NM refleja el nivel de actividad de PFP.

Material requerido

Centrífuga a baja temperatura, espectrofotómetro, Baño de agua/incubadora de temperatura constante, mortero/homogeneizador, 1 cubeta de cuarzo ml, pipeta de transferencia, hielo y agua destilada, tubo EP.

Procedimiento:

I. Muestra Extracción:

1. 1. Muestra de tejido:

Según la masa del tejido. (gramo): el volumen de la solución de extracto (mililitros) es 1: 5 ~ 10. Sugirió 0.1g de tejido con 1 ml de solución de extracto. Moler completamente en hielo, centrifugado a 20000 g y 4 ℃ para 15 mín.. El sobrenadante se coloca en hielo para realizar la prueba..

2. Bacterias o células:

Según el número de células. (104): el volumen de la solución de extracto (mililitros) es 500 ~ 1000: 1. Recomendar 5 millones con 1 ml de solución de extracto. Utilice ultrasonidos para dividir bacterias o células. (potencia 300W, tiempo de trabajo 3s, intervalo 7s, Tiempo Total 3 mín.). Centrifugado en, 20000g y 4 ℃ para 15 mín.. El sobrenadante se coloca en hielo para realizar la prueba..

3. Líquidos: detección directa.

II. Determinación procedimiento:

• Precalentar el espectrofotómetro 30 mín., ajustar la longitud de onda a 340 Nuevo Méjico, poner a cero con destilado
• Agregue reactivos con la siguiente lista:

Nombre del reactivo (µL)	Tubo de ensayo (t)	tubo en blanco (t)
Reactivo 1	670	670
Reactivo 2	100	100
Reactivo 3	100	100
Reactivo 4	10	10
Reactivo 5	10	10
Reactivo 6	10	10
Muestra	100	–
Agua destilada	–	100
Después de mezclar bien, Mida el valor inicial A1 en 340 nm y la absorbancia A2 para 30 minutos a las 37 ° C en un 1 cubeta de cuarzo ml, y grabarlos como A1T, A1B, y A2T, A2B. Calcular ΔA = (A1T-A2T)- (A1B-A2B). Nota: Reactivos 1, 2, 3, 4, 5, y 6 También se puede formular en fluidos de trabajo de acuerdo con las proporciones de la tabla de operaciones, que ahora está preparado para su uso; Los tubos en blanco solo necesitan ser hecho 1–2 veces.

III. Cálculo de PFP actividad:

1 Calculado mediante cubeta de microcuarzo.

• Calculado por concentración de proteínas.:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la 1 mg de proteína de tejido por minuto consume 1 nmol de Nadh.

Actividad de PFP (Prot. U/mg) = ΔA ÷ （ε × D） × VRT × 109 ÷(VS×Cpr) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ CPR

• Calculado por peso de muestra.

Definición de unidad: Se define una unidad de actividad enzimática como que 1 g de tejido por minuto consume 1 nmol de Nadh.

Actividad de PFP (U/g peso fresco) = ΔA ÷ （ε × D） × VRT × 109 ÷(W × vs ÷ ve) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ W

• Calculado por bacterias o cantidad de células.:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la 10 mil bacterias o células por minuto consumen 1 nmol de Nadh.

Actividad de PFP (celda U/104) = ΔA ÷ （ε × D） × VRT × 109 ÷(Vs × n ÷ ve) ÷ t = 53.59 × ΔA ÷ n （104）

• Calculado por suero y otros líquidos:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la 1 Ml de líquidos por minuto consume 1 nmol de Nadh.

Actividad de PFP (unidades/mL) = ΔA ÷ （ε × D） × VRT × 109 ÷ vs ÷ t = 53.59 × ΔA

VRT: Volumen total del sistema de reacción, 0.001 l;

mi: Coeficiente de extinción molar NADH, 6.22 × 103 L/mol/cm; d: camino de luz de la cubeta, 1 cm;

contra: Volumen de muestra agregado, 0.1 mililitros;

Ver: Volumen de solución de extracto agregado, 1 mililitros; t: tiempo de reacción, 30 mín.;

RCP: concentración de proteína de la muestra, mg/mL; W.: masa de muestra, 0.1 gramo;

109:factor de conversión, 1 moles = 109 nmol n: número de celda

2. Calculado por una placa UV de 96 pocillos:

Modificar d = 1 cm en la fórmula anterior a D-0.6 cm (el camino de la luz de una placa de 96 pocillos) para el cálculo.

Nota:

1. El número de muestras no debe ser demasiado grande para evitar retrasar el tiempo de reacción enzimática.

Ejemplos experimentales:

1. Llevar 0.1 G de brotes de frijoles y agregar 1 ML de solución de extracto para el procesamiento de muestras. Después de la centrifugación para tomar el sobrenadante, proceda de acuerdo con el procedimiento de determinación. Calculación ΔA = (A1T-A2T)-(A1B-A2B)= (1.041-0.963)-0= 0.078. La actividad enzimática se calcula de acuerdo con la masa de la muestra.

Actividad de PFP (U/g peso fresco) = 53.59 × ΔA ÷ W = 41.8 U/g de peso fresco.

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