Glutatión Oxidado Solarbio (GSSG) Kit de ensayo de contenido

Glutatión oxidado (GSSG) Kit de ensayo de contenido

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: Espectrofotómetro/lector de microplacas

Numero de catalogo: antes de Cristo1185

Tamaño:100T/96S

Componentes:

reactivo yo:100 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Reactivo II: 130 µL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Reactivo III: 20 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Reactivo IV:2.5 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo V: Polvo ×1. Almacenamiento a 4 ℃. disolver con 2.5 mL de agua destilada cuando se utilizará la solución., luego dividir en paquetes más pequeños, almacenar a -20 ℃.

Reactivo VI:12.5 µL×1. Almacenamiento a 4 ℃. Prepare el Reactivo VI y agua destilada de acuerdo con el tamaño de la muestra en la proporción de 1:20 (V: V) antes de usar.

Estándar: Polvo 10 mg×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Descripción del Producto

Glutatión oxidado(GSSG) es una forma oxidada de glutatión (GSH), también conocido como ditioneglutatión, Formado por la oxidación de dos moléculas de glutatión.. GSSG se reduce a GSH por la glutatión reductasa, entonces la mayor parte del cuerpo está en forma reducida. La determinación del contenido de GSH y GSSG y la proporción de GSH/GSSG en las células puede reflejar el estado redox de las células.. Este kit utiliza la reacción del glutatión y 5, 5′-ácido ditiobis-2-nitrobenoico (DTNB) para producir 5-tio-2- ácido nitrobenzoico. 5-tio-2- El ácido nitrobenzoico tiene la mayor absorción en la longitud de onda de 412 Nuevo Méjico, y 2-vinilpiridina inhiben el glutatión reducido en el original de las muestras, y luego usar glutatión reductasa para reducir GSSG a GSH, determinar el contenido de glutatión oxidado.

Especificaciones técnicas

Límite mínimo de detección：3.211 µg/mL

Rango lineal：3.9-125 µg/mL

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados.

Balance analítico, mortero/homogeneizador, centrífuga refrigerada, baño de agua, pipeta ajustable, espectrofotómetro/lector de microplacas, cubeta de microvidrio/placa de fondo plano de 96 pocillos.

Procedimiento

I. Muestra preparación

1. 1. Muestra de tejido

Lave los pañuelos frescos con PBS dos veces., Luego añade 0.1 g de muestra en el homogeneizador (El homogeneizador se ha enjuagado con el Reactivo I y se ha colocado en hielo antes de su uso.). Agregar 1 mL de Reactivo I (la proporción de tejido y reactivos se puede mantener constante), moliendo completamente sobre hielo (Usar nitrógeno líquido tendrá un mejor efecto de molienda.). Centrifugar en 8000 ×g y 4℃ para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ durante 10 días.)

2. Muestra de sangre

Plasma: La muestra se centrifuga a 600 ×g y 4℃ para 10 minutos. Absorbiendo el plasma superior en otro tubo, agregue el mismo volumen de Reactivo I. Centrifugar en 8000 ×g y 4℃ para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ durante 10 días.)

Globulo:La muestra se centrifuga a 600 ×g y 4℃ para 10 minutos. Descartando el plasma superior, lavar con el triple de volumen de PBS durante 3 veces (Mezcle las células sanguíneas con una centrífuga de PBS a 600 ×g para 10 minutos), añadir un volumen igual de reactivo I. Después de mezclar, se coloca a 4 ℃ para 10 minutos. Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ durante 10 días.)

3. muestra celular

La celda de recolección no debe ser inferior a 106, luego lavar con PBS dos veces (mezclar la celda con una centrífuga de PBS a 600 × g para 10 minutos), mezclar la célula precipitada con el volumen de PBS para 3 veces. Congelación y descongelación repetidas 2 o 3 veces (sugerir congelado en nitrógeno líquido, disuelto en baño de agua a 37 ℃). Centrifugar en 8000 ×g para 10 minutos, tomar el sobrenadante y colocarlo a 4 ℃ para realizar la prueba. (El sobrenadante se puede almacenar a -80 ℃ durante 10 días.)

II. Procedimiento

1. Precaliente el espectrofotómetro/lector de microplacas para 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 412 Nuevo Méjico, poner el contador a cero con destilado
2. Precalentar el reactivo II en un baño de agua durante 30 minutos: 37℃ (célula de mamífero) o 25 ℃ (otras especies).
3. La dilución estándar: disolver el estándar con 1 ml de agua destilada (4℃) a una concentración de 10 mg/mL. Tome la solución adecuada para preparar el estándar de concentración de 125μg/mL.、 5µg/mL、31.25µg/mL、15.625µg/mL、7.8125µg/mL、3.90625μg/ml y 0 μg/ml (El diluyente es un Reactivo I diez veces diluido.).

4. Agregar 20 μL de estándar diluido o muestra para 0.5 tubo de centrífuga de ml, agregar 1 µL de Reactivo II, incubar en 37 ℃ para 30 minutos después de mezclar.
5. Hacer curvas estándar

Después de la incubación, agregar 140 µL de Reactivo III, 20 μL de reactivo IV, 20μL de reactivo V, y 2 µL de Reactivo VI al tubo estándar en secuencia. Después de una mezcla rápida, la absorción de luz A1 y A2 de 30 arena 150 s respectivamente se midieron en 412 Nuevo Méjico. absorbancia (A2-A1) es la abscisa (X) y la concentración es la ordenada (y), haciendo la curva estándar.

Agregar 140 µL de Reactivo III, 20 μL de reactivo IV, 20 μL de reactivo V, y 2 µLof Reactivo VI a los tubos de muestra en secuencia. Después de una mezcla rápida, la absorción de luz A1 y A2 de 30 arena 150 s respectivamente se midieron en 412 Nuevo Méjico, ΔA= A2- A1.

III. Cálculos

Según la curva estándar, muestra ΔA en la fórmula (X), calcular la concentración de muestra de y

(µg/ml).

• Concentración de proteínas

GSSH (µg / mg de beneficio)=y×Vrv÷Vrv÷Cpr =y÷Cpr

• Peso de la muestra

GSSH (µg/g)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×W)= y÷W

• cantidad de celda

GSSH (µg /106 celúla)= y×Vrv÷(Vrv÷Vsv×N)= y÷N

• Volumen de solución

GSSH (µg / mililitros)= y×Vrv/Vs= 2y

norte: cantidad de celda,106；

Soga: Volumen total de reacción, 0.203 mililitros；

vsv: El volumen de sobrenadante se añadió al sistema de reacción., 20 µL=0,02 ml； W.: Peso de la muestra, gramo;

RCP: Concentración de proteína sobrenadante, mg/mL.

Notas:

1. La muestra debe homogeneizarse por completo.. Si la prueba no se puede completar temporalmente, se puede almacenar a-80 ℃.
2. Si el contenido de GSSG en la muestra es incierto, Se pueden diluir varios gradientes antes de la medición..
3. Este método utiliza la velocidad de reacción enzimática para calcular la concentración del sustrato y completar las lecturas con la mayor precisión posible en 30 y 150
4. El reactivo I contenía precipitante de proteínas., el sobrenadante no pudo usarse para determinar la concentración de proteínas. Si es necesario determinar el contenido de proteínas, tomar otro pañuelo.

Referencia:

• Alpert A J, Gilbert H.F.. Detección de glutatión oxidado y reducido con una reacción postcolumna de reciclaje.[j]. Bioquímica analítica, 1985, 144(2):553-562.
• Owens CW I, Belcher R Un micrométodo colorimétrico para la determinación de glutatión[j]. Revista bioquímica, 1965, 94(3): 705.

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