Solarbio Lactato Deshidrogenasa (LDH) Kit de ensayo de actividad

Lactato deshidrogenasa (LDH) Kit de ensayo de actividad

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Equipo de operación: Espectrofotómetro/lector de microplacas

No gato: BC0685

Tamaño:100T/48S

Componentes:

Extraer solución: 60 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃；

reactivo yo: 7 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo II: polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃. Solución de trabajo: disolver con 1.3 ml de agua destilada antes de usar. Se puede dividir en túbulos después de coincidir, que se puede conservar durante dos semanas a -20 ℃. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Reactivo III: 7 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo IV: 25 mL×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Solución estándar de piruvato de sodio: 1 mililitros (2 µmol/mL) × 1. Almacenamiento a 4 ℃.

Descripción del Producto:

Lactato deshidrogenasa (LDH o LD) es la enzima terminal de la vía de la glucólisis que se encuentra en casi todas las células vivas (animales, plantas, y procariotas). LDH cataliza la conversión de lactato a ácido piruvico y espalda, ya que convierte nad+ en nadh y viceversa.

Nad+ y el ácido láctico se oxidan al ácido pirúbico mediante la catálisis de LDH. El piruvato reaccionó aún más con 2,4-dinitrofenilhidrazida para formar piruvato dinitrobenzona, que muestran color rojo marrón en solución alcalina y la profundidad de color es proporcional a la concentración de piruvato.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

Lector de espectrofotómetro/microplato, Baño de agua del termostato, centrífuga de escritorio, pipeta ajustable, cubeta de microvidrio/placa de fondo plano de 96 pocillos, mortero/homogeneizador, hielo, agua destilada.

Procedimiento:

I. Muestra preparación:

1. Bacterias, células, o muestra de tejido:

Bacterias o células:

Recoger bacterias o células en el tubo de centrífuga.. El líquido en la capa superior se descarta después de la centrifugación. La relación entre las bacterias/la cantidad de células (104): Volumen de solución de extracción (mililitros) es 500 ~ 1000:1(Se sugiere que se tome 5 millones de bacterias/células y agregar 1 mL de solución de extracto). Las bacterias y la célula están divididas por ultrasonic (colocado sobre hielo, 200W., tiempo de trabajo 3s, intervalo 10s, repetir para 30 veces). Centrifugar en 8000 RPM 4 ℃ para 10 minutos, Tome el sobrenadante y póngalo en hielo para la prueba.

Tejido:

La homogeneidad de la beca de hielo se realiza de acuerdo con la proporción de masa tisular (gramo): Volumen de solución de extracción (mililitros) = 1: 5~10 (se recomienda tomar 0.1 g de tejido y agregar 1 mL de solución de extracto). Homogeneización de baño de hielo. Centrifugar en 8000 RPM y 4 ℃ para 10 minutos, Tome el sobrenadante y póngalo en hielo para la prueba.

2. Suero (plasma)muestra:

Detectar la muestra directamente.

II. Procedimiento:

1. Precaliente el lector de espectrofotómetro/microplaca 30 minutos, ajustar la longitud de onda a 450 Nuevo Méjico, poner a cero con agua destilada.
2. Solución estándar de piruvato de sodio: llevar 100 μL de solución estándar, diluir 1, 5, 0.25, 0.125, 0 µmol/mL, y usar 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 μmol/ml como curva estándar.

3. Prueba de muestra

Nombre del reactivo (µL)	Tubo de ensayo(En)	tubo de control(C.A)	tubo estándar(Como)
Muestra	10	10	–
Solución estándar	–	–	10
reactivo yo	50	50	50
Reactivo II	10	–	–
Agua destilada	–	10	10
Mezclado completamente, incubar a 37 ℃(mamífero) o 25 ℃(otras especies) baño de agua para 15 minutos.
Reactivo III	50	50	50
Mezclado completamente, incubar a 37 ℃(mamífero) o 25 ℃(otras especies) baño de agua para 15 minutos.
Reactivo IV	150	150	150

Mezclado completamente, lugar a temperatura ambiente para 3 minutos. Llevar 200 μL de solución de reacción en micro cubeta de vidrio/placa de fondo plano bien 96, medido la absorbancia en 450 Nuevo Méjico, ΔA = AT-AC. Cada tubo de ensayo debe establecer un tubo de control.

III. LDH Cálculos.

1. Muestra de contenido de piruvato de sodio
2. Establecer la curva estándar, eje y como concentración estándar, µmol/mL, x-eje como el 450 absorción de nm. Poner ΔA(X) en la curva estándar, calcular y(µmol/mL)
3. Suero (plasma) Muestra de actividad LDH

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmol de ácido piruvico por minuto, Cada mililitro de suero.

LDH(unidades/mL)= y ÷ t × 103 = 66.7 × y

4. Tejido, Bacterias o células cultivadas Actividad LDH

A. Concentración de proteínas:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmol de ácido piruvico por minuto, cada miligramo de proteína.

LDH(Prot. U/mg)= y ÷ t ÷ cpr × 103 = 66.7 × y ÷ cpr

B. Peso de la muestra

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmol de ácido piruvico por minuto, en cada gramo de tejido. LDH(u/g)= y ÷ t ÷ w × 103 = 666.7 × y

C. cantidad de celda

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima cataliza la producción de 1 nmol de ácido piruvico por minuto cada 10000 células.

LDH(U/104 celda)= y ÷ t ÷ 500 × 103 = 0.133 × y

contra: volumen sobrenadante (mililitros), 0.01 mililitros; vsv: Volumen de solución de extracción, 1 mililitros; t: Tiempo de reacción, 15 minutos;

RCP: Concentración de proteína de muestra, mg/mL; W.: Peso de la muestra, 0.1 gramo;

500: Número total de bacterias o células., 5 millón; 103: 1 μmol/ml = 103 nmol/ml.

Referencias

[1] Huang P H, Fu L C, Huang C S, et al. La absorción de oligogalacturónido y su efecto sobre la inhibición del crecimiento, actividad de lactato deshidrogenasa y liberación de galactina-3 de células cancerosas humanas[j]. Química de alimentos, 2012, 132(4): 1987-1995.

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