Solarbio Gliceraldehído-3-fosfato Deshidrogenasa(GAPDH) Kit de ensayo de actividad

Gliceraldehído-3-fosfato Deshidrogenasa(GAPDH) Kit de ensayo de actividad

Nota: Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba..

Instrumento de detección: espectrofotómetro

No gato: BC2210

Tamaño: 25T/24 ; 50T/48S

Componentes:

Extraer solución: 60 mL×1. Almacenar a 4 ℃.

reactivo yo: Polvo × 1. Almacenar a -20 ℃.

Reactivo II: 50 mL×1. Almacenar a 4 ℃.

Reactivo III: 30 µL×1. Almacenar a 4 ℃. El líquido se coloca en el tubo EP en la botella de reactivo.. Según la dosis y la proporción en volumen del Reactivo III: agua destilada de 3:100, mezclar bien, Úselo y prepárelo ahora.

Descripción del Producto:

GAPDH (CE 1.2.1.12) Cataliza la oxidación del gliceraldehído 3-fosfato a 1,3-difosfoglicérido.. Es la enzima clave de la vía de la glucólisis.. Está estrechamente relacionado con la vía de la gluconeogénesis., el mantenimiento de la concentración de glucosa en sangre y la aparición de diabetes. Desempeña un papel importante en los trastornos de la glucosa., Metabolismo de lípidos y proteínas..

3-La fosfoglicerato quinasa puede catalizar la producción de 1,3-difosfoglicérido a partir de trifosfato y ATP.. GAPDH cataliza inversamente la formación de gliceraldehído-3-fosfato, fósforo inorgánico y NAD+ de 1,3-difosfoglicérido y NADH. La disminución de NADH medida en 340 nm puede reflejar la actividad de GAPDH.

Material requerido

Centrífuga de escritorio, espectrofotómetro ultravioleta, baño maría a temperatura constante, mortero/homogeneizador, 1 cubeta de cuarzo ml, transferidor, hielo y agua destilada.

Procedimiento:

I. Muestra Extracción:

1. Muestra de tejido:

Según la masa del tejido. (gramo): el volumen de la solución de extracto (mililitros) es 1: 5~10. sugerido 0.1 g de tejido con 1 mL de solución de extracto. Moler completamente en hielo, centrifugar en 8000 g y 4 ℃ para 20 mín.. El sobrenadante se coloca en hielo para realizar la prueba..

2. Bacterias o células:

Según el número de células. (104): el volumen de la solución de extracto (mililitros) es 500 ~ 1000: 1. Recomendar 5 millones con 1 mL de solución de extracto. Utilice ultrasonidos para dividir bacterias o células. (fuerza 20% o 200W, tiempo de trabajo 3s, intervalo 10s, repetir para 30 veces). Centrifugar en, 8000 g y 4 ℃ para 10 mín.. El sobrenadante se coloca en hielo para realizar la prueba..

3. Suero (plasma): medición directa.

II. Determinación procedimiento:

• Precalentar el espectrofotómetro ultravioleta. 30 mín., ajustar la longitud de onda a 340 nm, poner a cero con agua destilada.
• Preparación de la solución de trabajo.: vierta todo el Reactivo II en una botella de Reactivo I. Completamente disuelto. Precalentar una cierta cantidad de 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies) para 10 mínimo según sea necesario. Los reactivos no utilizados se almacenarán a - 20 ℃ después de la subcarga.. Evite la congelación y descongelación repetidas.
• Agregue reactivos con la siguiente lista:

Nombre del reactivo (µL)	Tubo de ensayo (t)	tubo en blanco (B)
Muestra	30
Agua destilada		30
Reactivo III	20	20
Solución de trabajo	950	950
Agregue los reactivos anteriores al 1 cubeta de cuarzo de ml respectivamente. Mezclar bien. Mida el valor de absorbancia A1 en 340 nm durante 10s. Póngalo rápidamente en un baño de agua o en una incubadora a 37 ℃ (mamífero) o 25 ℃ (otras especies) para 5 mín.. Sácalo y sécalo rápidamente.. Mida el valor de absorbancia A2 durante 5 min 10 s.. Calcular ΔAT= A1T- A2T, ΔAB= A1B- A2B, ΔA = ΔAT – ΔAB. El tubo en blanco solo necesita probarse 1 o 2 veces.

III. Cálculo:

Calculado mediante cubeta de microcuarzo.

• Calculado por concentración de proteínas.:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que se consume de 1 nmol de NADH en el sistema de reacción por minuto, cada mg de proteína.

Actividad de GAPDH (Prot. U/mg) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×Cpr)÷T=1072×ΔA÷Cpr

• Calculado por peso de muestra.

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que se consume de 1 nmol de NADH en el sistema de reacción por minuto, cada g de muestra.

Actividad de GAPDH (U/g peso fresco) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×W÷VST)÷T= 1072×ΔA÷W

• Calculado por bacterias o cantidad de células.:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que se consume de 1 nmol de NADH en el sistema de reacción por minuto, cada 104 bacterias o células.

Actividad de GAPDH (celda U/104) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷(VS×500÷VST)÷T = 2,14×ΔA

• Calculado por volumen de medio de cultivo.:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzimas que se consume de 1 nmol de NADH en el sistema de reacción por minuto, cada ml de líquido.

Actividad de GAPDH (unidades/mL) =ΔA÷(ε×d)×VRV×109÷VS÷T= 1072×ΔA

 

mi: coeficiente de extinción molar de NADH: 6.22×103 L/mol/cm; d: trayectoria de luz de la cubeta, 1 cm;

la cuerda: volumen total de reacción, 0.001 l;

contra: volumen de muestra en el sistema de reacción, 0.03 mililitros; VST: volumen de solución de extracción añadido, 1 mililitros; RCP: concentración de proteína de la muestra, mg/mL;

W., masa de muestra, gramo;

t: tiempo de reacción, 5 mín.;

109: factor de conversión, 1 moles = 109 nmol;

500: Número de celdas, 5 millón.

Nota:

1. Cuando A1 es menor que 0.8 o ΔA es mayor que 0.7, Se recomienda diluir la muestra antes de la determinación..
2. El tubo en blanco es un tubo de ensayo para probar la calidad de cada componente reactivo.. En condiciones normales, el cambio no excede 01.

Ejemplo experimental:

1. Tomar 0,1 g de riñón de conejo., agregar 1 mL de solución de extracto, homogeneizar en baño de hielo, luego centrifugar a 8000g, 4℃ para 20 mín., tomar el sobrenadante y ponerlo en hielo, luego opere con una cubeta de microcuarzo de acuerdo con los pasos de determinación, medir y calcular: ΔAT=A1T-A2T =0,815-0,158=0,657, ΔAB= A1B – A2B=0,865-0,864=0,001, ΔA = ΔAT – ΔAB = 656.

Actividad de GAPDH (masa U/g) = 1072×ΔA ÷ W = 7032.32 masa U/g.

2. Toma 0,1 g de trébol., agregar 1 mL de solución de extracto, homogeneizarlo en baño de hielo, luego centrifugarlo en 8000g y 4℃ para 20 mín., tomar el sobrenadante y ponerlo en hielo, luego opere de acuerdo con los pasos de determinación, medirlo y calcularlo con una cubeta de microcuarzo, ΔAT = A1T – A2T=1,026-1,017=0,009, ΔAB= A1B – A2B=0,865-0,864=0,001, ΔA = ΔAT – ΔAB=008.

Actividad de GAPDH (masa U/g) = 1072 × ΔA ÷ W =85,76 U/g de masa.

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