Atributo	Detalles
Nota	Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba.
Equipo de operación	espectrofotómetro
No gato	BC3230
Tamaño	25T/24S; 50T/48S

Componentes:

Extraer solución: 80ml×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo 1: 40ml×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Reactivo 2: Polvo × 1. Almacenamiento a -20 ℃, disolver con 1ml de acetona. El reactivo disuelto 2 se puede almacenar a -20 ℃ después de dispensar. Diluido 100 veces cuando se usa.

Reactivo 3: Polvo × 1. Almacenamiento a 4 ℃, disolver con 3ml de acetona antes de usar. Reactivo 4: 5ml×1. Almacenamiento a 4 ℃.

Descripción del Producto:

El complejo mitocondrial II es lo mismo que la succinato-Co-enzima Q reductasa, que existe ampliamente en las mitocondrias de los animales., planta, microorganismos y células cultivadas. Cataliza el ácido succínico para formar ácido fumárico., reducir FAD para formar FADH2. El FADH2 reduce la CoQ oxidada para formar CoQ reducida., que es una rama de la cadena respiratoria de transporte de electrones.

CoQ que un producto catalítico del complejo II podría reducir el 2,6-dicloroindofenol, que tiene absorbancia en 605 Nuevo Méjico, La actividad de la enzima se puede calcular detectando la tasa de disminución de 2, 6-diclorindolefeno.

Reactivos y equipos necesarios pero no suministrados:

espectrofotómetro, baño de agua, centrífuga de escritorio, pipeta de transferencia, 1cubeta de vidrio ml, mortero/homogeneizador, acetona, hielo y agua destilada.

1. Complejo II extracción:

• Recoger 0,1 g de tejido o 5 millones de células, agregue 1 ml de solución de extracto y muela en hielo con mortero/homogeneizador;
• centrifugar a 600 gy 4 ℃ para 10 mín.. Descartar el precipitado y transferir el sobrenadante a otro tubo., centrifugar en, 11000g y 4 ℃ para 15 mín.;
• el sobrenadante, es decir., extracto citoplasmático, Se puede utilizar para determinar el complejo II que se escapa de las mitocondrias., este paso puede mostrar el efecto de la extracción mitocondrial;
• Agregar 400 solución de extracción μL para sedimentar, división con ultrasonidos (fuerza 20%, tiempo de trabajo 5s, intervalo 10s, repetir 15 veces), utilizado para detectar la actividad del complejo Ⅱ y el contenido de proteínas.

Paso determinante

1. Precalentar el espectrofotómetro para 30 mín., ajustar la longitud de onda a 605 Nuevo Méjico, poner el contador a cero con destilado
2. Determinación de muestras

• Haciendo una solución de trabajo: mezclar reactivo 2 y reactivo 3 de acuerdo a 1:1 antes de usar. Preparar cuando se use. Preparado cuando se utilizará la solución..
• Precalentar el reactivo1 a 37 ℃ (célula de mamífero) o 25 ℃(otras especies) para 15
• Agregue los siguientes reactivos en una cubeta de vidrio de 1 ml.:

Nombre del reactivo (uL)	Tubo de ensayo (A1)
Muestra	50
Reactivo 1	750
Solución de trabajo	100
Reactivo 4	100
Agregue el reactivo anterior a la cubeta de vidrio de 1 ml., mezclar bien, detectar absorbancia a 10s (A1). Coloque la cubeta y la solución de reacción a 37 ℃(mamífero) o 25 ℃(otras especies) baño de agua para 2 mín., luego tome la cubeta rápidamente, secar y detectar absorbancia para 2 mín. (A2), ΔA=A1-A2

Cálculo:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de 2, 6-diclorindolefeno por mg de proteína tisular en cada minuto.

Actividad compleja Ⅱ (Prot. U/mg)=[ΔA×Vrv÷(ε×d)×109]÷(Vs×Cpr)÷T =476,2×ΔA÷Cpr

mi: 2, 6-coeficiente de extinción molar de dicloridolfeno, 2.1×104L/mol/cm3; d: trayectoria de luz de la cubeta, 1 cm;

Soga: volumen total de reacción,1mililitros; contra: volumen de la muestra (mililitros), 0.05 mililitros;

RCP: concentración de proteína de la muestra (mg/mL); t: tiempo de reacción (mín.), 2 mín.;

Nota:

1. Tome dos o tres muestras diferentes para predecir antes de la prueba para garantizar la precisión de los resultados experimentales.. Diluir el sobrenadante con agua destilada si la absorbancia es superior a 1.5. Diluir la muestra con agua destilada si ΔA>0.4, multiplicar los tiempos diluidos en la fórmula. Aumente el volumen de muestra si ΔA es lento.
2. Detecte el concentrado de proteína de muestra usted mismo, puedes usar Solarbio (PC0020 Proteína BCA Kit de ensayo). Porque la proteína está contenida en el extracto., El contenido de proteínas del extracto en sí debe restarse al determinar la concentración de proteínas de la muestra..
3. Se recomienda utilizar la concentración de proteína de la muestra para calcular la actividad enzimática.. Si se utiliza el peso fresco de la muestra para calcular, Es necesario medir la actividad enzimática del extracto citoplasmático., y la suma de la actividad enzimática del sobrenadante y la precipitación es la actividad enzimática total.
4. es suficiente para 50 reacciones del tubo.
5. Adjunto: Peso de la muestra(50T/24S)

• Flotante:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de 2, 6-diclorindolefeno en 1 min cada gramo de peso de tejido.

Actividad compleja Ⅱ(u/g)=[ΔA1×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =476,2×ΔA1÷W ΔA1: absorbancia del sobrenadante;

Soga: volumen total de reacción,1mililitros;

mi: 2, 6-coeficiente de extinción molar de dicloridolfeno, 2.1×104L/mol/cm3; d: trayectoria de luz de la cubeta, 1 cm;

ve: volumen de solución de extracción,1mililitros; contra: volumen de la muestra (mililitros), 0.05 mililitros; t: tiempo de reacción (mín.), 2 mín.;

W.: peso de la muestra, gramo.

• Sedimento:

Definición de unidad: Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza el consumo de 1 nmol de 2, 6-diclorindolefeno en 1 min cada gramo de peso de tejido.

Actividad compleja Ⅱ(u/g)= [ΔA2×Vrv÷(ε×d)×109]÷(W÷Ve×Vs)÷T =190,5×ΔA2÷W ΔA2: absorbancia de sedimentos;

Soga: volumen total de reacción,1mililitros;

mi: 2, 6-coeficiente de extinción molar de dicloridolfeno, 2.1×104L/mol/cm3; d: trayectoria de luz de la cubeta, 1 cm;

ve: volumen de sedimento resuspendido,0.4 mililitros; contra: volumen de la muestra (mililitros), 0.05 mililitros;

t: tiempo de reacción (mín.), 2 mín.; W.: peso de la muestra, gramo.

• La actividad total es la suma de la actividad del ComplejoⅡ en el sobrenadante y el sedimento.. Complejo Ⅱ(u/g) =476,2×ΔA1÷W+190,5×ΔA2÷W.

Ejemplo experimental:

1. Tome 0,1 g de muestra de hígado de conejo., agregar 1 mL de solución de extracto, moler y centrifugar el homogeneizado, y operar de acuerdo con los pasos de determinación. ΔA1 = A1-A2 = 1.134-1.054 = 0.08 en el sobrenadante, y ΔA2 =A1-A2 = 1.371-1.347 = 0.024 en la precipitación.

La actividad del complejo II en el sobrenadante. (masa U/g) = 476,2×ΔA1÷W = 476.2 × 0,08÷0,1 = 380.96 masa U/g

La actividad del complejo II en la precipitación. (masa U/g) = 190,5×ΔA2÷ W = 190,5×0,024÷0,1 = 45.72

masa U/g

Complejo II (masa U/g) = 476,2× ΔA1÷W + 190.5×ΔA2÷W = 476,2×0,08÷0,1 + 190.5×0,024 ÷ 0.1 =426,8U/g de masa.

Referencias：

[1] Mühling J., TiefenbachM, López-Barneo J, et al. El complejo mitocondrial II participa en la regulación normóxica e hipóxica de los α-cetoácidos en el corazón murino[j]. Revista de cardiología molecular y celular., 2010, 49(6): 950-961.

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