El procedimiento qPCR para la detección de Chlamydia implica dos pasos principales: Extracción de ADN y posterior amplificación y examen del ADN.. Inicialmente, Nos centraremos en compartir el contenido de aprendizaje relacionado con la extracción de ADN.. Este artículo profundiza principalmente en los fundamentos teóricos y una introducción a los reactivos utilizados..
Principios teóricos de purificación de la extracción de ADN. Antes de realizar experimentos., comprender los principios fundamentales y los procedimientos operativos es beneficioso. Nos ayuda a comprender el experimento., prever resultados potenciales, y evitar ser simplemente un operador repetitivo.
Principios básicos de la extracción de ADN.
Integridad de la estructura del ADN.: Por ejemplo, El principio detrás de la detección de Chlamydia basada en sondas qPCR implica la detección específica de Chlamydia mediante la amplificación de la región codificante de 16SrRNA en el genoma de Chlamydia.. La amplificación específica de Chlamydia se puede detectar a 520 nm. (canal familiar). El ADN incompleto de Chlamydia no se sometería a la amplificación y detección características.
Consideraciones:
(1) Para asegurar esto, Nuestros procedimientos experimentales deben implicar un manejo suave para evitar la degradación del ADN..
(2) Se debe prestar atención a la inactivación de las ADNasas..
(3) Si solo adquirimos el kit de reactivos qPCR Chlamydia sin el correspondiente kit de reactivos de extracción, No solo necesitamos probar la aplicabilidad del kit de prueba, sino también validar la efectividad de nuestro proceso de extracción..
1.1.2 Pureza del ADN: Esforzarse por eliminar otras sustancias moleculares grandes que puedan interferir con el ADN., evitando así cualquier impacto en experimentos posteriores. Asegúrese de que la muestra extraída no contenga disolventes orgánicos ni altas concentraciones de iones metálicos que inhiban las enzimas..
Consideraciones:
(1) Se aplican consideraciones similares al limitar el recuento total de células en muestras de células., ya que el ADN no objetivo dentro de otras sustancias moleculares grandes puede afectar el experimento.
(2) Una nota de precaución para el control de calidad (control de calidad): El muestreo no debe ser excesivo.. Si bien es posible que desee aumentar el volumen de la prueba para lograr representatividad en el control de calidad, Se debe tener precaución en tales casos..
(3) Es importante entender nuestras muestras.; si contienen disolventes orgánicos o iones metálicos que inhiben las enzimas, Necesitamos confirmar si estas sustancias se pueden eliminar eficazmente antes del experimento o si sus concentraciones se pueden reducir mediante métodos de cultivo celular..
(4) La contaminación por otros ácidos nucleicos es un factor de interferencia común..
Particularmente, al manipular clamidia o agitar en vórtex muestras positivas de clamidia, Se pueden generar aerosoles.. Por eso, durante el examen de clamidia, Las operaciones asépticas estrictas dentro de un gabinete de bioseguridad son cruciales., y se recomienda una centrifugación rápida después de agitar.
Pasos de extracción de ADN
La extracción de ADN implica solo dos pasos: lisis y purificación celular.
- Lisis celular La lisis celular rompe la estructura de las células de la muestra., liberar ADN y otros componentes celulares en una solución. Los métodos para la lisis del ADN incluyen mecánicos., químico, y procesos enzimáticos.
- Los métodos mecánicos a menudo implican la molienda con nitrógeno líquido..
- métodos químicos como CTAB y Ficha de datos de seguridad (MSDS) objetivo de disolver las membranas celulares. CTAB actúa como limpiador catiónico., mientras que SDS es un limpiador aniónico, ambos ayudan en la disolución de la membrana celular. Los limpiadores desnaturalizan las proteínas., alterar las estructuras de la membrana y liberar proteínas conectadas a los ácidos nucleicos.
- Acción enzimática, como la digestión por la proteinasa K.
Consideraciones:
(1) Para los objetivos de detección de nuestros productos de terapia celular, particularmente sobrenadantes de células, La digestión enzimática es un enfoque más suave y sencillo..
(2) La actividad enzimática está influenciada por factores ambientales como la temperatura y los iones de sal.. Comprender la muestra inicial es crucial para evitar posibles efectos de disolventes orgánicos o altas concentraciones de iones de sal.. Se pueden agregar buffers para crear un entorno de fondo apropiado..
Purificación del ADN La purificación separa el ADN de otros componentes celulares como las proteínas., lípidos, polisacáridos, y ARN.
Una vez que se lisan las estructuras celulares, El enfoque básico para aislar el ADN se basa en explotar las diferencias en las propiedades físicas y químicas entre el ADN y otros componentes como el ARN., proteínas, y lípidos.
- El ADN tiene la solubilidad más baja en una solución de NaCl de 0,14 mol/L.. Disolver el ADN en una solución con alta concentración de sal puede eliminar impurezas insolubles en alta concentración de sal.. La precipitación del ADN con una solución baja en sal elimina las impurezas solubles en baja sal.
- La mayoría de las proteínas son intolerantes a temperaturas entre 60 y 80 ℃., mientras que el ADN se desnaturaliza por encima de 80 ℃.
- El ADN no se disuelve en alcohol, pero ciertas proteínas dentro de las células pueden disolverse en él..
Consideraciones:
(1) Comprender estos puntos ayuda a comprender varios métodos de purificación..
(2) Al verificar la efectividad de la extracción y purificación., Podrían ser necesarias modificaciones o adiciones a un paso específico según principios experimentales..
Métodos comunes de extracción de ADN para el examen de ADN de clamidia, Es fundamental comprender los métodos de examen convencionales que ofrecen los fabricantes de kits de prueba de clamidia.. Los métodos comunes incluyen métodos basados en perlas y basados en precipitación.. Métodos de filtración, debido a mayores costos, actualmente no son considerados, considerando el costo, el método de la columna centrífuga puede ser una preferencia personal.
Método de precipitación El método de precipitación implica la extracción con fenol/cloroformo para eliminar proteínas y etanol/isopropanol para precipitar el ADN.. El fenol extrae proteínas desnaturalizadas de la fase acuosa., inhibir la degradación del ADN por las ADNasas. El cloroformo acelera la separación de fases orgánicas y acuosas., eliminar el fenol residual.
Consideraciones:
(1) El miedo al cloroformo me hace sentir incómodo frente a una campana extractora.
(2) Teniendo en cuenta su capacidad para manejar grandes volúmenes de muestras, Me inclino a probar este método..
(3) Existe una ligera preocupación sobre si el método de precipitación podría precipitar impurezas., por lo que se necesita más investigación.
Método de columna centrífuga
Este método implica una solución de unión única/proteinasa K que descompone rápidamente las estructuras celulares y desactiva las nucleasas celulares.. El ADN genómico se adhiere selectivamente a la membrana a base de silicio dentro de la columna centrífuga en un estado rico en sal.. A través de una serie de pasos rápidos de lavado y centrifugación., Las sustancias inhibidoras se eliminan junto con los metabolitos celulares y las proteínas., dejando atrás ADN genómico purificado, que luego se eluye de la membrana a base de silicio utilizando un tampón de elución bajo en sal.
Consideraciones:
(1) es bastante seguro, pero el volumen de muestra puede ser un poco bajo.
(2) El volumen limitado de los tubos de recogida restringe el espacio operativo..
(3) Para garantizar la detección, El ADN necesita ser concentrado., lo que reduce aún más el volumen de pipeteo. Dominar la pipeta es crucial.
(4) Considerando los costos, El método de columna centrífuga es una opción temporal..
Método de cuentas magnéticas
Los pasos principales del método de las perlas magnéticas implican la lisis., vinculante, Lavado, y elución. Los pasos específicos no se detallan aquí..
El tampón de lisis utilizado en este método desnaturaliza las proteínas., Provocando lisis celular y desnaturalización de proteínas unidas al ADN.. Las perlas magnéticas adsorben específicamente el ADN.. A través del lavado, impurezas como ARN y proteínas., aparte del ADN, son eliminados. Entonces, la solución de elución disocia el ADN unido a las perlas, dando como resultado ADN altamente puro y concentrado para PCR amplificación.
El método de las perlas magnéticas combina nanotecnología y biotecnología, utilizando nanopartículas magnéticas que consisten principalmente en materiales biológicamente activos que exhiben paramagnetismo. Estas perlas tienen una capa superficial capaz de sufrir intercambio catiónico., facilitar la adsorción de ácidos nucleicos. El material de la superficie se une a los ácidos nucleicos mediante enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas.. El principio de purificación implica unir ácidos nucleicos en condiciones de alto contenido de sal y eluirlos en ambientes de bajo contenido de sal.. Además, Las perlas magnéticas se agregan o dispersan en condiciones de campo magnético., eliminando la necesidad de operaciones manuales como la centrifugación.
Consideraciones:
(1) El quid del método de las perlas magnéticas está en las perlas.. Algunos kits contienen una cantidad limitada de cuentas., incitando a los expertos a establecer su propio sistema. Esperando sus logros.
(2) Al seleccionar un soporte magnético, opta por uno visible.
Evaluación de la pureza del ADN
Después de la extracción de ADN, evaluando la pureza, concentración, y la integridad es esencial. Los métodos comunes incluyen:
- Electroforesis en gel: Este método utiliza gel de agarosa para determinar el ARN residual., proteínas, fenol, u otros metabolitos en el ADN extraído. Además, El brillo de la banda indica la integridad del ADN.. Electroforesis en gel, comparando el brillo de la banda con marcadores de ADN, estima aproximadamente la concentración de ADN.
- espectrofotometría: Los anillos de benceno de las bases de ADN o ARN absorben fuertemente en el rango ultravioleta a 260 nm.. Las proteínas exhiben una absorción máxima a 280 nm., mientras que las sales y las moléculas pequeñas se concentran a 230 nm. Usando un espectrofotómetro, El principio es que la absorbancia se correlaciona con la concentración de ADN.. La evaluación de la pureza del ADN generalmente implica medir la DO260, OD280, y valores OD230, juzgar la pureza en función de sus proporciones.
Generalmente, El ADN puro tiene una proporción OD260/OD280 de aproximadamente 1.8. Una proporción superior 1.9 sugiere degradación del ADN o contaminación del ARN, mientras que abajo 1.7 indica restos de proteínas. La electroforesis en gel a menudo se realiza inicialmente para evaluar la pureza y la integridad., seguido de espectrofotometría UV para medir la concentración.
Método de detección QBIT
Esta técnica utiliza tintes fluorescentes que emiten fluorescencia al unirse a moléculas objetivo específicas.. El instrumento mide los valores de fluorescencia y los convierte en datos de concentración.. Comparado con la espectrofotometría, este método es más sensible, específico, y preciso en la detección.
Consideraciones:
(1) Considerando los costos, metodos 1.5.1 y 1.5.2 Actualmente son más convenientes durante el desarrollo de métodos de extracción..
(2) Para confirmar la efectividad de la extracción., Se necesitan medidas posteriores de control de calidad.. Al desarrollar métodos de forma independiente., Elegir controles de calidad efectivos es esencial..
Introducción a la información sobre los reactivos de purificación y extracción de ADN
He recopilado resúmenes de varios reactivos que podrían usarse para una mejor comprensión.. Esta compilación es para fines de referencia., no original, destinado exclusivamente al intercambio educativo.
Proteinasa K Proteinasa K, aislado de hongos blancos, Es una potente enzima digestiva de proteínas con alta actividad específica., crucial para la extracción de ADN. Permanece activo dentro de un amplio rango de pH. (4-12.5) y a altas temperaturas (50-70 grados centígrados). Los agentes quelantes como el EDTA o los agentes desionizantes como el SDS no lo desactivan..
Proteinasa K, una serina proteasa con amplia actividad de escisión, Corta los enlaces peptídicos en el extremo carboxilo de los aminoácidos alifáticos y aromáticos.. Digiere varias proteínas de membrana y glicoproteínas de las membranas celulares y nucleares y también digiere histonas unidas al ADN..
Cloruro de sodio (NaCl) NaCl ayuda a eliminar proteínas unidas al ADN. Neutralizando la carga negativa del ADN, Permite que las moléculas se agreguen y mantiene las proteínas disueltas en la capa de agua., evitando su precipitación con ADN en alcohol.
La concentración de sal juega un papel importante cuando las células están expuestas a soluciones hipotónicas o hipertónicas., conduciendo a la ósmosis.
EDTA EDTA quela cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+, que existen en las enzimas, Reducir la actividad enzimática de las ADNasas y las ARNasas.. Por ejemplo, Las enzimas DNasa requieren iones Mg2+ como cofactores para su actividad. La quelación de iones Mg2+ con EDTA inactiva la ADNasa, protegiendo el ADN. Los iones de magnesio también son necesarios para la agregación de proteínas y ácidos nucleicos., mientras que los iones de calcio son esenciales para la integridad de la pared celular y la estabilidad de la membrana..
Fenol, un disolvente orgánico insoluble en agua, Se utiliza con cloroformo y alcohol isoamílico para la purificación del ADN., Eliminación de contaminantes de proteínas y polisacáridos.. Cuando se agita con extractos celulares, Los componentes no polares de las células se fraccionan en fenol., dejar componentes polares en agua. El ADN permanece sin disolver en fenol porque es un disolvente no polar.. Por otro lado, Las proteínas contienen grupos polares y no polares debido a diferentes aminoácidos en sus largas cadenas.. El plegamiento de proteínas en secundarias., terciario, y las estructuras cuaternarias también dependen de la polaridad de los aminoácidos..
Centrifugación con una mezcla de fenol.: y cloroformo:
alcohol isoamílico en un 25:24:1 la proporción produce tres capas: acuoso, interfase, y organico. ADN, Cargada negativamente y polar a pH neutro a alcalino., permanece hidrófilo y se retiene en la fase acuosa. Los aminoácidos hidrofóbicos de las proteínas protegen el ADN en la solución acuosa. Sin embargo, tras la desnaturalización, Los ácidos nucleicos no polares están expuestos., haciendo que las proteínas y ciertos polisacáridos precipiten en la interfase.
La combinación fenol-cloroformo reduce la distribución de poli.(A) y ARNm en la fase orgánica y minimiza la formación de complejos insolubles de ARN-proteína en la interfase. El fenol retiene alrededor del 10 al 15% de la fase acuosa., resultando en una pérdida similar de ARN. El cloroformo previene la retención de agua., mejorando así el rendimiento.
Sólo se debe utilizar fenol neutro, ya que el fenol ácido disuelve el ADN., o fenol, por acción oxidativa, se transforma en quinonas, Generando radicales libres que degradan los ácidos nucleicos..
Cloroformo
El cloroformo es un no polar. (hidrofóbico) Disolvente en el que se disuelven proteínas y lípidos no polares.. Esto fomenta la distribución de lípidos y restos celulares en la fase orgánica., proteger el ADN separado en la fase acuosa. Con una densidad relativamente alta (1.47 gramos/cm³), El cloroformo asegura la separación de los dos líquidos., Permitir que las fases orgánica y acuosa se separen claramente y ayudar a eliminar la fase acuosa mientras se minimiza la contaminación cruzada con la fase orgánica.. Dado que el cloroformo es inherentemente volátil, no obstaculiza los procesos posteriores.
Suplemento: Cómo utilizar fenol y cloroformo para la extracción de ADN y eliminar proteínas?
El fenol y el cloroformo son moléculas apolares., mientras que el agua es una molécula polar. Cuando una solución de proteína y agua se mezcla con fenol o cloroformo, Las moléculas de agua entre las moléculas de proteínas son desplazadas por el fenol o el cloroformo., haciendo que las proteínas pierdan su estado hidratado y se desnaturalicen. Después de la centrifugación, proteínas desnaturalizadas, más denso que el agua, separar de la fase acuosa y precipitar debajo de ella, Separación del ADN disuelto en la fase acuosa.. Fenol y cloroformo, siendo disolventes orgánicos, Tienen sus ventajas y desventajas en la eliminación de proteínas.. El fenol tiene un efecto desnaturalizante más significativo pero se disuelve parcialmente en la fase acuosa., resultando en una pérdida de aproximadamente 10% a 15% del ADN en la fase acuosa. El efecto desnaturalizante del cloroformo no es tan efectivo como el del fenol, pero no se disuelve en agua, por lo tanto no lleva ADN. De este modo, una combinación de fenol y cloroformo produce los mejores resultados durante el proceso de extracción.
isopentanol (isopropanol)
El cloroformo expuesto al aire forma gases nocivos, fosgeno. Si solo se usa cloroformo, la captura de gas provoca formación de espuma o burbujeo, dificultando la purificación correcta del ADN entre las dos fases. En este punto, La combinación de cloroformo con isopropanol u octanol evita la emulsión de la solución durante el proceso de extracción..
ARNasa A
ARNasa A es una endorribonucleasa que cataliza la hidrólisis de los 3′,5′-enlace fosfodiéster del ARN en el 5′-enlace éster en una reacción de dos pasos. El primer paso es la transfosforilación., resultando en la terminación de un oligonucleótido que termina en pirimidina 2′,3′-fosfato cíclico. El segundo paso es la hidrólisis del fosfato cíclico para producir un 3-fosfodiéster terminal.. El ADN carece de los 2 cruciales′-OH, haciéndolo resistente a la digestión por la RNasa A.
Isopropanol/Etanol
El etanol precipita el ADN de la solución de extracción.. ADN, con una columna vertebral de fosfodiéster, es esencialmente hidrófilo. Las moléculas de agua forman una capa de hidratación alrededor del ADN mediante enlaces de hidrógeno. Se utiliza isopropanol/etanol para precipitar el ADN., alterar la capa de hidratación. El isopropanol es una buena opción para la precipitación del ADN.. Requiere un volumen menor (0.6–0,7 veces el volumen del sobrenadante). ARN, con un 2'OH adicional, Tiende a ser más soluble en agua y precipita selectivamente., dejando atrás el ADN. El isopropanol puede disolver disolventes no polares como el cloroformo., eliminando así las impurezas de los pasos anteriores.
Típicamente, Se utiliza isopropanol frío., pero los investigadores sugieren temperatura ambiente para evitar la precipitación de polisacáridos. Mientras que las bajas temperaturas aumentan el rendimiento del ADN, podrían aumentar las impurezas.
isopropanol (Ventajas: requiere menos volumen, precipitación rápida, adecuado para baja concentración, muestras de ADN de gran volumen; Desventajas: propenso a coprecipitar sales con ADN; necesita múltiples lavados con 70% etanol) Etanol (Ventajas: precipitación mínima con sales, El etanol residual en la precipitación del ADN se evapora fácilmente., no afecta experimentos posteriores; Desventajas: mayor volumen total, necesita almacenamiento prolongado a -20°C para una precipitación efectiva, requiere 70% lavado con etanol)
Acetato de sodio/acetato de amonio/acetato de potasio/cloruro de sodio/cloruro de litio/cloruro de potasio
Las sales en los procedimientos de extracción funcionan neutralizando las cargas en la columna vertebral de azúcar y fosfato del ADN.. Acetato de sodio a pH 5.2 Se utiliza comúnmente junto con el etanol para la precipitación de ácidos nucleicos.. en solución, El acetato de sodio se disocia en Na+ y [CH3COO]- iones. Los iones de sodio cargados positivamente neutralizan las cargas negativas del PO3.- de la cadena principal de azúcar-fosfato del ácido nucleico, Reducir la repulsión entre las moléculas de ADN.. Esto disminuye significativamente la hidrofilicidad de las moléculas de ADN., reduciendo así en gran medida su solubilidad en agua.
Etanol
Lavar los precipitados de ADN con 70% etanol para eliminar el exceso de sal, centrífugo, y desechar el etanol, dejando el ADN en el precipitado. Secar al aire o al vacío el precipitado.. Evite el secado excesivo, ya que esto puede dificultar la disolución del ADN más adelante..
Tris-EDTA (EL) Solución tampón/agua estéril
En métodos anteriores de aislamiento de ADN., El ADN necesitaba ser secado y almacenado, luego diluido según sea necesario. Hoy en día, para almacenamiento a largo plazo, Es prudente almacenar el ADN en un tampón que mantenga su pH y evite la degradación.. El búfer TE contiene Tris (10 milímetro) y EDTA (1 milímetro), donde Tris actúa como tampón y EDTA como agente quelante. Para aislamiento de ADN, El pH generalmente se establece en 7.5-8.5. La débil alcalinidad del tampón TE ayuda a prevenir la posibilidad de hidrólisis ácida., estabilizar aún más el ADN en agua.
El componente Tris amino en el tampón TE protege las cadenas de ADN del daño por radiación en soluciones sólidas y líquidas.. Cuando la radiación genera radicales libres, puede dañar las cadenas de ADN. De este modo, en soluciones fluidas a temperatura ambiente, Tris actúa eliminando los radicales libres de hidroxilo..
EDTA tiene como objetivo quelar iones Mg2+ en soluciones necesarias para la actividad DNasa o RNasa, Proteger el ADN de los ataques de DNasa o RNasa..
Se puede utilizar agua esterilizada para el almacenamiento de ADN a corto plazo. Si se utiliza tampón TE para el almacenamiento de ADN, El agua esterilizada debe diluirla aún más para reducir la concentración de EDTA.. Esto garantiza que los iones de magnesio estén disponibles para la actividad de la polimerasa durante la PCR.. Los componentes del tampón en TE podrían impedir la amplificación del ADN si es necesario secuenciar el ADN más adelante.
