Proteinase K ist wichtig Enzym verwendet in Molekularbiologie -Labors zum Verdauen und Entfernen von Proteinen aus Nukleinsäurebereichungen. Dieses proteolytische Enzym hat wichtige Eigenschaften, die es für Forschungsanwendungen außerordentlich nützlich machen. In diesem Beitrag, Wir werden untersuchen, was genau Proteinase K ist, wie es funktioniert, und seine vielen Verwendungszwecke im Labor.
Was ist Proteinase K??
Proteinase K ist eine aus dem Pilz Tritirachiumalbum isolierte Serinprotease, die Serinprotease isoliert wurde. Es kann Proteine schnell in kleinere Peptidfragmente und Aminosäuren verdauen.
Der Name „Proteinase k“ kommt von seiner Fähigkeit, Keratin zu verdauen, ein hartes strukturelles Protein, das in den Haaren zu finden ist, Nägel, Gefieder, usw. Das Pilz -Tritirachium -Album sezerniert Proteinase K, wenn Keratin als einzige Stickstoffquelle bereitgestellt wird.
Was sind die Fakten über Proteinase K.?
Einige wichtige Fakten über Proteinase K.:
- Einstufung: Gehört zur Peptidase -Familie S8 (Subtilisin -Familie)
- Katalytischer Typ: Serinprotease
- Optimaler pH:5 – 12.0
- Optimale Temperatur:50°C – 65°C
- Molekulargewicht:28,930 Und
Proteinase K enthält eine katalytische Triade von drei Aminosäuren – Aspartat, Histidin, und Serin. Das Serin wirkt als Nucleophil, das Peptidbindungen spaltet. Kalziumionen sind wichtig für die vollständige enzymatische Aktivität.
Wie funktioniert Proteinase K??
Als Serinprotease, Proteinase K katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen neben der Carboxylgruppe aliphatischer und aromatischer Aminosäuren.
Sein Wirkungsmechanismus ähnelt dem von anderen Serinproteasen wie Chymotrypsin und Trypsin. Hier sind die wichtigsten Schritte:
- Das katalytische Serin des Enzyms initiiert einen nucleophilen Angriff auf den Carbonylkohlenstoff mit Peptidbindungen.
- Dies bildet eine tetraedrische intermediäre Intermediate, die durch Wasserstoffbrückenbindung stabilisiert ist.
- Die Stickstoff-Kohlenstoffbindung bricht dann dann, das erste Produkt freigeben und ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt bilden.
- Ein Wassermolekül deaktiviert das Enzym, das zweite Produkt freigeben.
- Dadurch regeneriert sich die aktive Serinstelle für eine weitere Katalyserunde.
Proteinase K spaltet Proteine an Innenpeptidbindungen als Endopeptidase. Es hat keine strenge Spezifität, sondern bevorzugt große hydrophobe Rückstände. Dadurch kann es die meisten Proteine schnell in kleinere Fragmente zerlegen.
Wofür wird Proteinase K verwendet??
Proteinase K ist zu einem wesentlichen Reagenz für die molekulare Biologieforschung geworden. Hier sind einige seiner häufigsten Verwendungszwecke:
Verdauen Sie kontaminierende Proteine
Bei der Isolierung von DNA oder RNA aus Zellen und Geweben, Proteinase K wird verwendet, um kontaminierende Proteine zu verdauen. Dies entfernt Verunreinigungen aus Nukleinsäureinbereitungen. Waschmittel hinzufügen wie Sicherheitsdatenblatt Hilft Proteinen für eine verstärkte Verdauung frei.
Inaktivierende Nukleasen inaktivieren
Viele Nukleasen, die DNA und RNA abbauen können, sind selbst Proteine. Proteinase K inaktiviert diese schädlichen Nukleasen durch proteolytische Spaltung schnell. Dies schützt isolierte Nukleinsäuren vor Abbau.
Gewebeverdauung
Proteinase K kann helfen, Zellen zu dissoziieren und Gewebe zu löschen, Freisetzung von Nukleinsäuren zur Extraktion. Es ist in Gewebe -Lyse -Puffern für DNA/RNA -Reinigungsprotokolle enthalten.
Proteinanalyse
Die Protease erzeugt spezifische Peptidfragmente, die Informationen über die Proteinstruktur liefern. Proteinase K -Verdauungsmuster sind nützlich für die Untersuchung der Proteindomänen, Änderungsstellen, usw.
Inaktivieren infektiöse Prionen
Als Endopeptidase, Proteinase K kann die fehlgefalteten Prionproteine verdauen, die für die übertragbare spongiforme Enzephalopathien wie die Krankheit von Creutzfeldt-Jakob verantwortlich sind. Es wird verwendet, um die Prion -Kontamination inaktivieren zu können.
DNA -Sequenzierung
Einige DNA -Sequenzierungsmethoden verwenden Proteinase K, um die DNA -Polymerase nach Sequenzverlängerung zu entfernen, Vorbereitung der DNA für die Elektrophorese.
In -situ -Hybridisierung
Das Enzym kann feste Zellen/Gewebe für die Hybridisierung von Nucleotidsonden sanft permeabilisieren und gleichzeitig die RNA- und DNA -Integrität beibehalten.
Welche Bedingungen benötigt Proteinase K??
Im Folgenden sind die Bedingungen, die Proteinase K erfordert, um ordnungsgemäß zu funktionieren.
Temperatur
Proteinase K weist eine hohe Aktivität von 50 ° C bis 65 ° C auf, mit einer optimalen Temperatur von etwa 60 ° C. Es behält selbst bei 37 ° C eine gewisse proteolytische Fähigkeit bei. Die höheren Temperaturen machen Proteinstrukturen wahrscheinlich zugänglicher.
pH
Dieses Enzym funktioniert über einen weiten pH -Bereich von pH -Wert 4 zu pH 12, mit maximaler Aktivität zwischen pH 7.5 Und 12. Alkalische Bedingungen sind am besten, Aber neutraler pH funktioniert auch gut.
Reinigungsmittel
Hinzufügen von ionischen Reinigungsmitteln wie SDs (Natriumdodecylsulfat) kann die Proteinase -K -Aktivität verbessern, indem Proteinsubstrate denaturieren. Nichtionische Waschmittel wie Triton X-100 auch arbeiten.
Trennkationen
Proteinase K erfordert Kalziumionen für die vollständige enzymatische Aktivität und Stabilität. EDTA chelatiert Calcium und kann das Enzym hemmen. Jedoch, Proteinase K behält noch eine Funktion ohne Kalzium bei.
Wie wird Proteinase K im Labor verwendet??
Proteinase K hat wichtige Funktionen im Labor und es wird im Labor auf folgende Weise verwendet:
Proteinase K -Pufferrezept
Ein typischer Proteinase -K -Verdauungspuffer enthält:
- 10 mm Tris-hcl pH 8.0
- 100 MM NaCl
- 5% Sicherheitsdatenblatt
- 50 μg/ml Proteinase K
Die Tris behält einen alkalischen pH -Wert von rund um 8.0. NaCl liefert einige ionische Stärke. SDS Denatiert Proteine zur Verdauung. Der Puffer kann nach Bedarf geändert werden.
Verdauungsprotokoll
- Fügen Sie dem Puffer kurz vor der Verwendung Proteinase K hinzu.
- Proben im Puffer inkubieren für 30 min bis 2 HRs bei 50 ° C bis 65 ° C.
- Proteinase k durch Erhitzen bei 95 ° C für inaktivieren 10 min oder verwendet PMSF.
Längere Verdauungen oder eine höhere Temperatur können die Aktivität erhöhen. Der Stichprobenkontext bestimmt optimale Bedingungen.
Vorsicht!
Proteinase K ist eine sehr starke Protease. Es ist darauf zu achten, dass kontaminierende Proben oder abbauende Proteine analysiert werden, die analysiert werden sollen. Tragen Sie immer Handschuhe und verwenden Sie dedizierte Vorräte.
Wie wird Proteinase K inaktiviert??
Sobald Proteinase K seinen Zweck erfüllt hat, Es muss inaktiviert werden, um die weitere Verdauung zu stoppen. Hier sind einige Methoden:
- Heizung: Temperaturen über 90 ° C inaktivieren schnell das Enzym. Jedoch, Heizung beseitigt die Restaktivität nicht vollständig.
- PMSF: Dieser irreversible Serinprotease -Inhibitor modifiziert kovalent den katalytischen Serin, dauerhaft blockieren Aktivitäten.
- Aebsf: Ein weiterer Serinprotease -Inhibitor, der Proteinase K dauerhaft inaktiviert.
- TCA: Trichloressigsäure Denatures und fällt das Enzym aus.
Heizung ist die bequemste Methode, Serinprotease -Inhibitoren liefern jedoch eine vollständige Inaktivierung.
Was sind einige Alternativen zu Proteinase K.?
Einige Alternativen von Proteinase K umfassen:
- Pronase: Ein unspezifischer Proteasemisch, der aus Streptomyces griseus isoliert ist.
- Trypsin: Eine Serinprotease mit Spezifität für Lysin und Arginin.
- Pepsin: Eine asspartische Protease aus Magensaft von Säugetieren. Funktioniert am besten unter sauren Bedingungen.
- Papain: Eine Cysteinprotease aus Papaya. Häufig zur Zelldissoziation verwendet.
Jeder hat eine gewisse Überlappung mit Proteinase K bei abbauenden Proteinen, Aber ihre spezifischen Eigenschaften unterscheiden sich. Proteinase K ist immer noch die am häufigsten für allgemeine Laborzwecke verwendete.
Abschluss
Die leistungsstarke Serinprotease -Proteinase K ist für die molekulare Biologieforschung und -diagnostik unverzichtbar. Seine bemerkenswerte Fähigkeit, Proteine schnell zu verdauen und gleichzeitig unter harten Bedingungen aktiv zu bleiben.
Verstehen, was Proteinase K ist, wie es funktioniert, und seine optimalen Arbeitsbedingungen ermöglichen es den Forschern, ihr volles Potenzial im Labor zu nutzen. Diese vielseitige Protease ermöglicht weiterhin unzählige Techniken, indem störende Proteine beseitigt und schädliche Nukleasen inaktiviert werden, um DNA und RNA der höchsten Reinheit wiederherzustellen.
