Was ist AFLP? Das vollständige Prinzip und Betriebsprozess

Einführung

• AFLP ist eine DNA -Molekularmarker -Technologie, die DNA -Polymorphismus nachlässt.
• Die Hauptmerkmale der AFLP -Technik sind:
  • Erfordert eine kleine Menge DNA für die Analyse, Nur 0,5 g.
  • Zeigt eine gute Reproduzierbarkeit.
  • Zeigt einen starken Polymorphismus.
  • Bietet hohe Auflösung.
  • Erfordert keine südliche Hybridisierung.
  • Geeignet für eine Vielzahl von Proben.
  • Zeigt eine stabile Vererbung.
• In Bezug auf technische Funktionen, AFLP ist ein Produkt, das Rapd und RFLP kombiniert.
• Es überwindet die Nachteile der Komplexität und radioaktiven Gefahren der RFLP -Technologie, und die Instabilität und Dominanz genetischer Marker in RAPD gleichzeitig die Stärken beider.
• In den letzten Jahren, Diese Technologie wurde kontinuierlich verbessert und entwickelt, AFLP wird schnell zur bislang effektivsten molekularen Methode.

Das Prinzip von AFLP

• AFLP ist auch eine DNA -Molekularmarker -Technologie, die DNA -Polymorphismus nachlässt.
• Jedoch, AFLP beinhaltet die Verstärkung der enzymgeschnittenen Fragmente durch PCR Reaktion zuerst, und dann die amplifizierten Enzym-Schnittfragmente auf einem hochauflösenden Sequenzierungsgel elektrophorieren. Polymorphismus wird auf der Grundlage der verschiedenen Längen der amplifizierten Fragmente nachgewiesen.
• Im Experiment, Die Enzym-geschnittenen Fragmente werden zunächst an künstliche Adapter ligiert, die kompatible zusammenhängende Enden enthalten. Die Abfolge dieser zusammenhängenden Enden, zusammen mit der Adaptersequenz, dient als Bindungsstelle für nachfolgende PCR -Reaktionen.
• Abhängig von den Anforderungen, verschiedene Primer mit 1 Zu 3 Selektive Nukleotide, die an den Enden hinzugefügt wurden. Diese selektiven Nukleotide ermöglichen es den Primern, Enzym-Schnitt-Fragmente mit spezifischen Paarungssequenzen selektiv zu erkennen, führt zu einer spezifischen Verstärkung.

Reagenz, das im Test verwendet wird

Versuchsverfahren

1. Genomische DNA -Extraktion und Reinigung

Siehe DNA -Extraktionsmethoden.

DNA-Reinigung:

• Elektrophorese von DNA -Fragmenten auf a 0.8% Agarosegel (enthält 0,5 & mgr; g/ml Ethidiumbromid, Eb), Mitnahme 1/3 der extrahierten genomischen DNA zur Reinigung.
• Erstens, das Volumen der extrahierten DNA mit TE -Puffer auf ein Gesamtvolumen von auffüllen 50 μl.
• Einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahieren (25:24:1) und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Zentrifuge und Übertragung des Überstands in ein Eppendorf -Röhrchen.
• Hinzufügen 1/10 NAAC-Volumen und das doppelte Volumen von vorgekühltem absolutem Ethanol, und mindestens bei -20 ° C platzieren 2 Std.. Zentrifuge bei 10.000 g für 10 Protokoll.
• Waschen Sie den DNA -Niederschlag zweimal mit 70% Ethanol, Luft trocken, und sich auflösen 30 μl TE -Puffer.
• Messen Sie A260- und A280-Werte mit einem UV-2401PC (Shimadzu) UV -Spektrophotometer zur Quantifizierung.
• Elektrophorese von DNA -Fragmenten auf a 0.8% Agarosegel (enthält 0,5 & mgr; g/ml Eb) zur Größenbestimmung.

Notiz:

• Für 0,1-0,2 g Gewebe, Lösen Sie in 100 & mgr; l Lösung e. Für 0,5 g Gewebe, Erhöhen Sie die Lösung E auf 300 μl. An dieser Stelle, Die DNA -Konzentration beträgt ungefähr 100 ng/μl.

2. Beschränkung der Verdauung und Ligation

In einer 0,2 ml Zentrifugenröhre, hinzufügen:

• Ca. 250ng Template DNA,
• 2.5μl 10 × Restriktionsenzym Verdauungspuffer,
• 2.5μl 10 × T4 -DNA -Ligase -Puffer,
• 5 Einheiten von Ecori,
• 5 Einheiten von MSEI,
• 2 T4 -DNA -Ligase Einheiten,
• 50PMOL MSEI -Adapter,
• Doppelt destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 25 μl.

Inkubieren Sie die Mischung in einem PCR -Thermocycler über Nacht auf 37 ° C. Nach Verdauung, die Enzyme inaktivieren durch Inkubation bei 65 ° C für 20 Protokoll. Speichern Sie die Reaktion bei -20 ° C zur weiteren Verwendung als Vorlage vor der Amplifikation.

3. Vorverstärkung

Nehmen Sie 3 μl des enzymverdauten und ligierten Produkts und addieren Sie:

• 75von e+ein Primer,
• 75von m+c primer,
• 15MM Mg2+,
• 25mm dntps,
• 1 Einheit von Taq-Polymerase,
• 3μl von 10 × PCR -Puffer,
• Fügen Sie doppeltes destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 30 μl hinzu.

Stellen Sie die PCR -Reaktionsparameter wie folgt ein:

• Anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 90 Sekunden,
• Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden,
• Tempern bei 56 ° C für 1 Minute,
• Verlängerung bei 72 ° C für 1 Minute,
• Wiederholen Sie die obigen Schritte für 30 Fahrräder,
• Endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 10 Protokoll (mit a PCR-Maschine von PE Company).

Nach der Reaktion, Analysieren Sie die Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese auf a 0.8% Agarosegel (enthält 0,5 & mgr; g/ml Eb). Nehmen Sie 3 μl des Produkts und verdünnen Sie es 50 Zeiten für die weitere Verwendung als Vorlage für die selektive Verstärkung.

4. Selektive PCR -Amplifikation

Nehmen Sie 3 μl des verdünnten Produkts und fügen Sie hinzu:

• 75von Ecorⅰ selektiver Primer,
• 75von mseⅰ selektiver Primer,
• 15MM Mg2+,
• 25mm dntps,
• 1 Einheit der Taq -Polymerase,
• 3μl von 10 × PCR -Puffer,
• Fügen Sie doppeltes destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 30 μl hinzu.

Stellen Sie die PCR -Reaktionsparameter wie folgt ein:

• Anfängliche Denaturierung bei 94 ° C für 90 Sekunden,
• Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden,
• Tempern bei 65 ° C für 1 Minute, dann durchführen 13 Fahrräder (Verringern Sie die Temperatur um 0,7 ° C pro Zyklus),
• Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden,
• Tempern bei 56 ° C für 1 Minute,
• Verlängerung bei 72 ° C für 1 Minute, dann durchführen 25 Fahrräder,
• Endgültige Verlängerung bei 72 ° C für 5 Protokoll (Verwenden einer PCR -Maschine von PE Company).

Erste, Analysieren Sie die Produkte der selektiven Amplifikation durch Elektrophorese auf a 0.8% Agarosegel (enthält 0,5 & mgr; g/ml Eb).

5. Gelelektrophorese

Trennen Sie die amplifizierten Produkte mit a 6% Denaturierende Polyacrylamidgel (0.5mm Dicke) und 1 × TBE -Elektrophorese -Puffer (Bio-Rad-Sequenzierungselektrophorese Apparat).

• Entfernen Sie den Kamm und führen Sie das Gel mit einer konstanten Leistung von 140 W für vor 30 Minuten, bis die Temperatur 47-49 ° C erreicht. Stellen Sie sicher, dass Sie Harnstoff aus jedem Brunnen auswaschen.
• Für die selektiven Amplifikationsprodukte, Fügen Sie ein gleiches Volumen des Ladepuffers hinzu (98% Formamid, 10MM EDTA, 0.25% Xylol Cyanol, 0.25% Bromphenolblau) und dieature bei 94 ° C für 5 Protokoll (Verwenden einer PCR -Maschine von PE Company). Nach der Denaturierung, schnell auf Eis legen, bis sie geladen werden.
• Beladen Sie 8 μl jeder Probe in jede Spur. Anfänglich, Führen Sie das Gel mit einer konstanten Leistung von 100 W für ungefähr 2 Minuten, um die Proben schnell am Boden der Brunnen zu konzentrieren. Dann an eine konstante Leistung von 60 W einstellen, Halten Sie die Temperatur bei 43 ° C, Bis das Bromophenolblau herumgeht 2/3 von der Entfernung von der Oberseite des Gels bis zur Glasplatte. Beenden die Elektrophorese.

6. Silberfärbung

• Fixierungslösung: 100 ml Gletscher Essigsäure zu 900 ml entionisiertem Wasser oder doppelt destilliertem Wasser hinzufügen.
• Färbungslösung: 1 g AGNO3 in 1L entionisiertem Wasser auflösen, dann hinzufügen 1.5 ml von 37% Formaldehyd.
• Entwicklungslösung: 30G NA2CO3 auflösen, 1.5 ml von 37% Formaldehyd, und 2 mg Natriumthiosulfat in 1l entionisiertem Wasser.

1. Nach der Elektrophorese, Legen Sie die Glasplatte mit dem Gel in ein Plastikschale zur Silberfärbung.
2. Fixierung: Fügen Sie die Fixierungslösung hinzu und schütteln Sie vorsichtig einen Schüttler für 30 Protokoll. Reservieren Sie die Fixierungslösung nach Fixierung.
3. Spülung: Waschen Sie das Gel dreimal mit entionisiertem Wasser für 2 Minuten jedes Mal.
4. Färbung: Legen Sie das Gel in eine Fleckenschale und gießen Sie die Färbungslösung ein (bei 4 ° C gehalten). Schütteln Sie vorsichtig auf einen Schüttler für 30 Protokoll. Nach dem Spülen des Gels mit entionisiertem Wasser für 10 Sekunden, Übertragen Sie es in das sich entwickelnde Tablett.
5. Entwicklung: Fügen Sie die sich entwickelnde Lösung hinzu (bei 4 ° C gehalten) und schütteln sanft, bis die Bänder aufhören, zu zunehmen.
6. Beendigung: Fügen Sie die verwendete Fixierungslösung aus dem Schritt hinzu 2 und ein paar Minuten aufregen. Spülen Sie einige Minuten mit destilliertem Wasser ab, sobald optimale Ergebnisse erzielt wurden.
7. Nach dem Entfernen von Wassertropfen aus dem Gel und der Glasplatte, Legen Sie es auf eine Leuchtkiste und fotografiert mit einer Nikon -Digitalkamera.

Zusammenfassung

Vielen Dank, dass Sie das vollständige AFLP -experimentelle Verfahren vorgelegt haben! Wenn Sie Fragen haben oder weitere Hilfe benötigen, Bitte fragen Sie uns, uns zu fragen. Wir bieten gerne Unterstützung und Antworten.