Entwicklung der PCR-Technologie
- Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine molekulare Biologie -Technik, mit der bestimmte DNA -Fragmente amplifiziert werden.
- Es kann als eine besondere Art der DNA-Replikation angesehen werden, die außerhalb lebender Organismen stattfindet.
- Die DNA-Polymerase, in der ich erstmals entdeckt wurde 1955.
- Das Klenow-Fragment von E. coli, entdeckt in den frühen 1970er Jahren von Dr. H. Klenow, hat experimentellen Wert und praktische Anwendbarkeit.
- Jedoch, Dieses Enzym ist nicht hitzebeständig und denaturiert bei hohen Temperaturen, Dies macht es für den Einsatz in der PCR ungeeignet, die eine Denaturierung bei hohen Temperaturen erfordert.
- Das heute häufig verwendete Enzym, bezeichnet als Taq-Polymerase, wurde aus dem Bakterium Thermus aquaticus isoliert 1976.
- Seine Eigenschaft der Hitzebeständigkeit macht es zu einem idealen Enzym, Die weitverbreitete Verwendung erfolgte jedoch erst nach den 1980er Jahren.
- Das ursprüngliche Konzept der PCR, ähnlich der Genreparaturreplikation, wurde von Dr. vorgeschlagen. Kjell Kleppe herein 1971.
- Er veröffentlichte das erste Experiment zur reinen und vorübergehenden Genreplikation (ähnlich den ersten beiden Zyklen der PCR).
- Die heute entwickelte PCR wurde von Dr. entwickelt. Kary B. Frühling herein 1983, als Mullis für die Firma PE arbeitete, Dies verschafft dem Unternehmen eine Sonderstellung im PCR-Bereich.
- Mullis und Saiki veröffentlichten offiziell den ersten entsprechenden Artikel in 1985.
- Seitdem, Die Anwendung der PCR hat sich rasant ausgeweitet, und die Qualität der entsprechenden Arbeiten hat viele andere Forschungsmethoden übertroffen.
- Anschließend, Die PCR-Technologie wird in der biologischen Forschung und in klinischen Anwendungen häufig eingesetzt, wird zu einer entscheidenden Technik in der molekularbiologischen Forschung.
- Mullis wurde 2010 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet 1993 für seinen Beitrag.
Das Prinzip der PCR
Das Grundprinzip der PCR-Technologie ähnelt dem natürlichen Replikationsprozess der DNA, und seine Spezifität hängt von den Oligonukleotidprimern ab, die an beiden Enden zur Zielsequenz komplementär sind. Die PCR besteht aus drei grundlegenden Reaktionsschritten: Denaturierung, Glühen, und Erweiterung:
- Denaturierung der Template-DNA: Nach Erhitzen der Template-DNA auf etwa 93 °C für einen bestimmten Zeitraum, die doppelsträngige DNA der Template-DNA oder die durch PCR-Amplifikation gebildete doppelsträngige DNA wird dissoziiert, Dadurch wird es einzelsträngig, sodass es an die Primer binden und sich auf die nächste Reaktionsrunde vorbereiten kann.
- Glühen (Neuvereinigung) von Template-DNA und Primern: Danach wird die Matrizen-DNA in Einzelstränge denaturiert, die Temperatur wird auf ca. 55°C gesenkt, und die komplementären Sequenzen der Primer und der einzelsträngigen Matrizen-DNA paaren sich und binden.
- Verlängerung von Primern: Mit der Wirkung der Taq-DNA-Polymerase, Verwendung von dNTPs als Reaktionssubstraten und der Zielsequenz als Matrize, nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung und semikonservativen Replikation, Es wird eine neue halbkonservative Replikationskette synthetisiert, die zur Matrizen-DNA-Kette komplementär ist. Diese Kette kann in Millionen von Kopien des darin enthaltenen Zielgens verstärkt werden 2 Zu 3 Stunden durch Wiederholen der Denaturierung, Glühen, und Erweiterungsprozesse.
PCR-Reaktionssystem und Reaktionsbedingungen Standard-PCR-Reaktionssystem
| Komponente | Volumen/Konzentration |
|---|---|
| 10x Verstärkungspuffer | 10μl |
| 4 Arten von dNTP-Mischungen | 200μl |
| Grundierungen | 10-100μl |
| Template-DNA | 0.1-2μg |
| Taq-DNA-Polymerase | 2.5μl |
| Mg2+ | 1.5mmol/L |
| Doppelt oder dreifach destilliertes Wasser | 100μl |
Die fünf Elemente der PCR-Reaktion:
- Grundierungen (PCR-Primer sind DNA-Fragmente, während Primer für die zelluläre DNA-Replikation RNA-Ketten sind)
- Enzym
- dNTPs
- Vorlage
- Pufferlösung (was Mg2+ erfordert)
Der Standard-PCR-Prozess besteht aus drei Schritten:
- Denaturierung von DNA (90°C-96°C): Unter Hitzeeinwirkung, die Wasserstoffbrückenbindungen in der doppelsträngigen DNA-Matrize brechen, Bildung einzelsträngiger DNA.
- Glühen (25°C-65°C): Die Systemtemperatur sinkt, Dadurch können die Primer an die DNA-Matrize binden, Bildung lokaler doppelsträngiger Regionen.
- Verlängerung (70°C-75°C): Mit der Wirkung der Taq-Polymerase (optimale Aktivität um 72°C), Verwendung von dNTPs als Substrate, Die Verlängerung erfolgt ab dem 5′ Ende bis zum 3′ Ende der Grundierung, Synthese eines zur Matrize komplementären DNA-Strangs.
Anmerkungen:
- Jeder Zyklus wird einer Denaturierung unterzogen, Glühen, und Erweiterung, Verdoppelung der DNA-Menge.
- Einige PCR-Protokolle, aufgrund des kurzen Verstärkungsbereichs, kann die Replikation auch dann abschließen, wenn die Taq-Polymerase-Aktivität nicht optimal ist.
- In diesen Fällen, Es kann eine zweistufige Methode verwendet werden, wobei Glühen und Streckung gleichzeitig bei einer Temperatur zwischen 60 °C und 65 °C erfolgen, Reduzierung der Anzahl der Temperaturzyklen und damit Verbesserung der Reaktionsgeschwindigkeit.
PCR-Reaktionseigenschaften
Starke Spezifität
Die Spezifität der PCR-Reaktion wird bestimmt durch:
- Spezifische und korrekte Bindung von Primern an die Template-DNA.
- Prinzipien der Basenpaarung.
- Genauigkeit der Taq-DNA-Polymerase-Synthesereaktion.
- Spezifität und Erhaltung des Zielgens.
Anmerkungen:
- Die korrekte Bindung der Primer an die Matrize ist entscheidend.
- Die Bindung von Primern an das Templat und die Verlängerung von Primerketten folgen den Prinzipien der Basenpaarung.
- Die Genauigkeit der Polymerase-Synthesereaktion und die Hitzebeständigkeit der Taq-DNA-Polymerase ermöglichen das Annealing (Neuvereinigung) Der Einfluss von Templat und Primern kann bei höheren Temperaturen auftreten, Dadurch wird die Spezifität der Bindung erheblich erhöht und ein hohes Maß an Genauigkeit für das amplifizierte Zielgensegment aufrechterhalten.
- Außerdem, durch Auswahl von Zielgenregionen mit hoher Spezifität und Konservierung, der Grad der Spezifität wird weiter erhöht.
Hohe Empfindlichkeit
- Die Menge an PCR-Produkt steigt exponentiell an, Ermöglicht die Verstärkung von Ausgangsvorlagenmengen aus Pikogrammen (pg=10^-12) auf Mikrogramm (μg=10^-6).
- Es kann eine Zielzelle aus einer Million Zellen erkennen.
- Bei der Virenerkennung, PCR-Empfindlichkeit kann erreicht werden 3 RFU (rekombinante bildende Einheiten), während in Bakteriologie, Die minimale Erkennungsrate beträgt 3 Bakterien.
Einfach und schnell
- PCR-Reaktionen verwenden hitzebeständige Taq-DNA-Polymerase.
- Sobald die Reaktionsmischung vorbereitet ist, Denaturierung, Glühen, und Verlängerungsreaktionen werden an einer DNA-Amplifikationsflüssigkeit und einem Wasserbad durchgeführt, Typischerweise wird die Amplifikationsreaktion abgeschlossen 2 Zu 4 Std..
- Amplifikationsprodukte werden üblicherweise durch Elektrophorese analysiert, ohne die Notwendigkeit der Verwendung von Isotopen, Dadurch wird die radioaktive Kontamination minimiert und die Verbreitung erleichtert.
Geringe Reinheitsanforderungen an Proben
- Es besteht keine Notwendigkeit, Viren oder Bakterien zu isolieren oder Zellen zu kultivieren; Roh-DNA und RNA können als Amplifikationsvorlagen verwendet werden.
- Klinische Proben wie Blut, Körperflüssigkeiten, Sputum, Haar, Zellen, und lebendes Gewebe kann direkt für den DNA-Amplifikationsnachweis verwendet werden.
PCR-Fehlerbehebung
Falsche Negative
Das Fehlen von Amplifikationsbanden in PCR-Reaktionen wird häufig durch Schlüsselfaktoren verursacht:
Template-Nukleinsäure-Vorbereitung
- Verunreinigungen wie Proteine in der Vorlage, das Vorhandensein von Taq-Polymerase-Inhibitoren, unvollständige Entfernung von Proteinen (insbesondere Histone) aus chromosomaler DNA, übermäßiger Verlust während der Vorlagenextraktion, oder das Einatmen von Phenol kann zu dem Problem beitragen.
- Möglicherweise spielt auch eine unvollständige Denaturierung von Template-Nukleinsäuren eine Rolle.
- Wenn Enzym- und Primerqualitäten gut sind, und Verstärkungsbänder erscheinen nicht, Dies liegt wahrscheinlich an Problemen bei der Probenverdauung oder an Fehlern im Extraktionsprozess der Template-Nukleinsäure.
- Es sollten wirksame und stabile Aufschlusslösungen hergestellt werden, und das Verfahren sollte festgelegt bleiben.
Enzyminaktivierung
Dies kann den Austausch des Enzyms durch ein neues oder die Verwendung einer Kombination aus alten und neuen Enzymen erforderlich machen, um zu analysieren, ob ein Verlust oder eine Insuffizienz der Enzymaktivität zu falsch negativen Ergebnissen führt. Manchmal, Auch das Vergessen der Zugabe von Taq-Polymerase oder Ethidiumbromid kann zu Problemen führen.
Primer-Probleme
- Qualität und Konzentration der Grundierungen, Symmetrie der Primerkonzentrationen, und Chargenschwankungen in der Qualität der Primersynthese können sich auf die PCR-Ergebnisse auswirken.
- Zu den Lösungen gehört die Auswahl seriöser Primer-Syntheseeinheiten, Bestätigung der Primerkonzentrationen durch Agarosegelelektrophorese, Dadurch werden für beide Primer ähnliche Bandenintensitäten gewährleistet, Lagerung von Primern in hohen Konzentrationen in kleinen Aliquots, um einen Abbau zu verhindern, und Sicherstellung eines rationalen Primer-Designs, um Probleme wie die Bildung von Primer-Dimeren zu verhindern.
Mg2+-Konzentration
Die Mg2+-Ionenkonzentration beeinflusst die Effizienz der PCR-Amplifikation erheblich. Zu hohe oder unzureichende Konzentrationen können die Spezifität oder Ausbeute beeinträchtigen, was zu einer fehlgeschlagenen Verstärkung führt.
Änderungen des Reaktionsvolumens
PCR-Volumina liegen typischerweise zwischen 20 μl und 100 μl, je nach Zweck. Sich ändernde Volumina sollten sorgfältig angepasst werden, um Ausfällen vorzubeugen.
Physikalische Faktoren
Denaturierung ist entscheidend, und unzureichende Denaturierungs- oder Annealing-Temperaturen können zu falsch negativen Ergebnissen führen. Die Verwendung von Standardthermometern zur Überprüfung der Thermocycler- oder Wasserbadtemperaturen kann dazu beitragen, Fehler zu vermeiden.
Variationen der Zielsequenz
Mutationen oder Deletionen in der Zielsequenz können die Primer-Matrizen-Bindung beeinträchtigen, was zu einer fehlgeschlagenen Verstärkung führt.
Falsch Positive
Die beobachteten PCR-Amplifikationsbanden stimmen mit den Zielsequenzbanden überein, manchmal erscheinen sie gleichmäßiger und heller. Mögliche Ursachen:
Unangemessenes Primer-Design:
Die Auswahl von Amplifikationssequenzen mit Homologie zu Nicht-Zielsequenzen kann während der PCR zu unspezifischen Amplifikationsprodukten führen. Kurze Zielsequenzen oder Primer können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Eine Neugestaltung der Grundierungen ist erforderlich.
Kreuzkontamination von Zielsequenzen oder Amplifikationsprodukten:
Kontaminationsursachen:
- Eine Kontamination des gesamten Genoms oder großer Abschnitte kann zu falsch positiven Ergebnissen führen.
- Auch die Kontamination kleiner Nukleinsäurefragmente in der Luft kann zu falsch positiven Ergebnissen führen.
Wie man mit dieser Situation umgeht
1. Strenge Laborpraktiken:
- Behandeln Sie Proben vorsichtig, um zu verhindern, dass Zielsequenzen in Pipetten eingeatmet werden oder aus Zentrifugenröhrchen herausspritzen.
- Autoklavieren Sie alle Reagenzien und Geräte, mit Ausnahme von Enzymen und Materialien, die hohe Temperaturen nicht vertragen.
- Verwenden Sie Einweg-Zentrifugenröhrchen und Pipettenspitzen, um Kontaminationen zu minimieren.
2. UV-Belichtung:
- Setzen Sie Reaktionsröhrchen und Reagenzien vor der Probenzugabe ultraviolettem Licht aus, um vorhandene Nukleinsäuren zu zerstören.
- Überlegungen zum Primer-Design:
- Entwerfen Sie Primer sorgfältig, um die Möglichkeit einer Kreuzreaktivität mit Nicht-Zielsequenzen zu minimieren.
- Verschachtelte PCR-Methoden:
- Implementieren Sie verschachtelte PCR-Methoden, um falsch positive Ergebnisse, die durch die Kontamination kleiner Nukleinsäurefragmente in der Luft verursacht werden, zu verringern oder zu beseitigen.
Auftreten unspezifischer Amplifikationsbanden
- Nach PCR-Amplifikation, Es erscheinen Bänder, deren Größe nicht mit den erwarteten übereinstimmt, entweder größer oder kleiner, oder sowohl spezifische als auch unspezifische Banden treten gleichzeitig auf.
- Die Gründe für das Auftreten unspezifischer Banden sind:
- Unvollständige Komplementarität zwischen Primern und Zielsequenzen, oder Primerdimerbildung.
- Übermäßige Mg2+-Ionenkonzentration, zu niedrige Glühtemperatur, und übermäßige Anzahl von PCR-Zyklen.
- Qualität und Quantität des Enzyms, wobei Enzyme aus einigen Quellen anfällig für unspezifische Banden sind, während andere es nicht sind.
- Eine übermäßige Enzymmenge kann manchmal zu einer unspezifischen Amplifikation führen.
- Zu den Gegenmaßnahmen gehören:
- Bei Bedarf Grundierungen neu gestalten.
- Verringerung der Enzymmenge oder Umstellung auf Enzyme aus anderen Quellen.
- Senkung der Primerkonzentration, die Template-Konzentration entsprechend zu erhöhen, und Reduzierung der Anzahl der Zyklen.
- Erhöhen Sie die Glühtemperatur entsprechend oder wenden Sie eine Zwei-Temperatur-Punkt-Methode an (Denaturierung bei 93°C, Glühen und Streckung bei ca. 65°C).
Auftreten von schmierenden oder streifigen Streifen
Die PCR-Amplifikation führt manchmal zu verschmierten oder streifenförmigen Banden.
- Dies wird häufig durch eine übermäßige Enzymmenge oder eine schlechte Enzymqualität verursacht, hohe dNTP-Konzentration, übermäßige Mg2+-Konzentration, niedrige Glühtemperatur, oder zu hohe Zyklenzahl.
- Zu den Gegenmaßnahmen gehören:
- Verringerung der Enzymmenge oder Umstellung auf Enzyme aus anderen Quellen.
- Abnehmende dNTP-Konzentration.
- Entsprechende Senkung der Mg2+-Konzentration.
- Erhöhung der Vorlagenmenge.
- Reduzierung der Zyklenzahl.
