Einführung von situ pcr
In wissenschaftlicher Forschung, Die Einrichtung jeder neuen Technologie bringt eine Reihe neuer Forschungsergebnisse hervor, Dadurch werden verschiedene Disziplinen vorgebracht. Im Bereich der morphologischen Forschung, Die Einführung des Elektronenmikroskops in den 1950er Jahren brachte detaillierte Studien von der Zellpegel auf die subzelluläre Ebene ein.
In den 1960er und 1970er Jahren, Die weit verbreitete Anwendung von Immunhistochemie und immunzytochemischen Technologien drückte Beobachtungen von subzellulären Strukturen auf den Proteinmolekularebene, Aktivierung der Lokalisierung zahlreicher aktiver Substanzen in Zellen oder subzellulären Werten. Dies hatte einen tiefgreifenden Einfluss auf die Entwicklung der medizinischen Biologie.
In den 1970er Jahren wurden molekulare Biologie -Techniken in der Morphologie ausgiebig angewendet, und mit dem Aufkommen von In -situ -Hybridisierung, Spezifische DNA- oder RNA -Sequenzen in Geweben und Zellen könnten lokalisiert werden. Diese fortgeschrittenen Beobachtungen von der Proteinebene bis zur Genebene, So vertiefen Sie das menschliche Verständnis vieler Lebensphänomene auf genetischer Ebene.
In den 1980er Jahren, Eine leistungsstarke Technik im Bereich der molekularen Biologie, PCR (Polymerase-Kettenreaktion), wurde eingeführt. Es wurde schnell in morphologischen Studien übernommen, Ermöglichen der Lokalisierung und Beobachtung spezifischer DNA oder RNA mit niedriger Kopie oder Einzelkopie in Zellen. Das Aufkommen dieser Technologie verspricht, mehr Forschungsergebnisse zu bringen, Morphologische Studien in einem signifikanten Schritt nach vorne nehmen.
Grundprinzipien
Das Grundprinzip der In-situ-PCR-Technologie besteht darin, die hocheffiziente Amplifikation der PCR-Technologie mit der zellulären Lokalisierung der In-situ-Hybridisierung zu kombinieren. Dies ermöglicht den In-situ-Nachweis spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen mit niedriger Kopie oder Einzelkopie in Gewebezellen.
Die PCR -Technologie verstärkt spezifische Zielsequenzen, die von Primern durch Denaturierungszyklen geleitet werden, Glühen, und Primerverlängerung unter der Wirkung der DNA -Polymerase. Die amplifizierten Zielsequenzen (Normalerweise kann um 10^6 Mal verstärkt werden) werden leicht durch Gelelektrophorese oder Southern -Blot -Hybridisierung angezeigt. daher, Die PCR -Technologie ist hochempfindlich und spezifisch, und mit der Automatisierung und Stabilität des Wärmefahrradfahrens, Es wird leicht zu bedienen. Jedoch, PCR wird in einer flüssigen Phase durchgeführt, Erfordernde Zellstörungen, um Nukleinsäuren als Vorlagen vor der Verstärkung zu extrahieren. Dies macht es schwierig, PCR -Ergebnisse mit der morphologischen Struktur von Gewebezellen zu korrelieren und den Zelltyp zu bestimmen, der die spezifische Zielsequenz enthält.
Die In -situ -PCR -Technologie kombiniert erfolgreich PCR und In -situ -Hybridisierung, Beibehalten der Vorteile beider und gleichzeitig ihre jeweiligen Mängel kompensieren. Die Proben für In -situ -PCR sind normalerweise chemisch fixiert, um gute morphologische Strukturen von Gewebezellen aufrechtzuerhalten. Sowohl Zellmembranen als auch Kernmembranen haben eine gewisse Durchlässigkeit, Komponenten wie Primer zulassen, DNA -Polymerase, und Nukleotide, um während der PCR -Amplifikation in Zellen oder Kerne einzudringen. Die feste intrazelluläre oder intranukleäre RNA oder DNA dient als Vorlagen für die In -situ -Amplifikation. Die amplifizierten Produkte sind im Allgemeinen große Moleküle oder verflechten sich miteinander, es ihnen schwer macht, durch die Zellmembran oder innerhalb der Membran zu diffundieren, somit in situ beibehalten. Hier entlang, Die ursprünglichen intrazellulären niedrigen DNA- oder RNA-Sequenzen mit niedriger Kopie oder Einzelkopie werden in situ exponentiell amplifiziert, und die amplifizierten Produkte können leicht durch In -situ -Hybridisierungstechniken erfasst werden.
Grundtypen
Basierend darauf, ob die in der Amplifikationsreaktion verwendeten Nukleotide oder Primer markiert sind, In -situ -PCR -Technologie kann in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: Direkte und indirekte Methoden. Zusätzlich, Es gibt die In -situ -Reverse -Transkriptions -PCR -Technologie.
Direkte In -situ -PCR -Technologie
In direkter In -situ -PCR -Technologie, Das amplifizierte Produkt trägt direkt ein markiertes Molekül, d.h., unter Verwendung markierter Adenosintriphosphat- oder Primerfragmente. Wenn das Probe einer PCR -Verstärkung erfährt, Die markierten Moleküle sind in das amplifizierte Produkt eingebaut, Anzeige der Marker, somit die spezifische DNA oder RNA in der Probe sichtbar machen (vor Ort).
Gemeinsame Marker sind das radioaktive Isotope ⁵s, Biotin, und Digoxigenin. Diese Marker‘ Positionen werden unter Verwendung der Autoradiographie visualisiert, Affinitätshistochemie, oder Immunhistochemie -Methoden.
Vorteile:
- Einfacher Betrieb
- Kurzer Prozess
- Zeitsparend
Nachteile:
- Niedrigere Spezifität
- Anfällig für falsch positive Ergebnisse
- Geringere Amplifikationseffizienz, vor allem in Paraffinabschnitten
Diese Nachteile sind in Paraffinabschnitten aufgrund potenzieller DNA -Schäden während der Verarbeitung herausragend (Fixierung, Dehydration, Einbettung). Beschädigte DNA kann mit den markierten Nukleotiden repariert werden, was zu falsch positiven Ergebnissen führt. Die Verwendung markierter Primer in direkter In -situ -PCR reduziert die Amplifikationseffizienz weiter.
Indirekte In -situ -PCR -Technologie
Die indirekte In -situ -PCR -Technologie beinhaltet die Amplifikation spezifischer DNA oder RNA in Zellen, gefolgt von In -situ -Hybridisierung mit markierten Sonden, signifikant Verbesserung der Spezifität. Diese Methode ist derzeit die am häufigsten verwendete In -situ -PCR -Technologie.
Unterschiede aus der direkten Methode:
- Das Reaktionssystem ist das gleiche wie herkömmliche PCR
- Keine Etiketten für Primer oder Adenosintriphosphat verwendet
In indirekter In -situ -PCR, Die Verstärkung wird zuerst erreicht, gefolgt vom Nachweis der amplifizierten spezifischen DNA -Produkte unter Verwendung von In -situ -Hybridisierungstechniken. Diese Methode ist auch als PCR -In -situ -Hybridisierung bekannt (Teig).
Vorteile:
- Höhere Spezifität
- Höhere Amplifikationseffizienz
Nachteile:
- Komplexere Betriebsschritte im Vergleich zur direkten Methode
In -situ Reverse Transcription PCR -Technologie
In -situ Reverse Transcription PCR (In-situ RT-PCR) ist eine neue Technologie, die Flüssigphasen-RT-PCR-Techniken auf Gewebezellproben anwendet. Im Gegensatz zu RT-PCR (flüssige Phase), Vor der In -situ -Reverse -Transkriptions -PCR, Gewebeproben werden mit DNase behandelt, um jede im Gewebe vorhandene DNA zu zerstören, Sicherstellen, dass die Vorlage für die Verstärkung synthetisiert wird cDNA aus mRNA, nicht die ursprüngliche DNA in der Zelle. Die anderen grundlegenden Schritte ähneln der Flüssigphasen-RT-PCR.
Grundschritte
Zu den grundlegenden Schritten der In -situ -PCR -Technologie gehören die Vorbereitung der Proben, In -situ -Amplifikation (PCR), und In -situ -Erkennung. Die Schritte sind nachstehend detailliert, mit einem Fokus auf Paraffinabschnitte als Beispiel.
Probenvorbereitung
In -situ -PCR -Technologie kann auf Zellsuspensionen angewendet werden, Zellabstriche, gefrorene Abschnitte, und Paraffinabschnitte. Im Vergleich zu anderen Methoden, Durch die Durchführung von In -situ -PCR in suspendierten intakten Zellen führt die besten Ergebnisse zu, während Paraffinabschnitte das Schlimmste liefern. Trotz dieses, Jüngste Fortschritte haben eine zufriedenstellende PCR -Effizienz in Paraffinabschnitten gemeldet.
Herausforderungen:
- Schlechte thermische Leitung und ungleichmäßige Hitzekonvektion auf Folien
- Adsorption von Taq -DNA -Polymerase durch Glasrutschen
- Mangel an intakten zytoplasmatischen oder Kernmembranen, die zu Diffuseverstärkungsprodukten führen
Fixierung:
- Formalin- oder Paraformaldehydfixierung (10% gepuffertes Formalin oder 4% Paraformaldehyd) Funktioniert gut für In -situ -PCR
- Optimale Fixierungszeit: 4-6 Stunden bei 4 ° C.
Abschnittsstärke:
- Dickere Abschnitte erzielen aufgrund eines höheren Ziel -DNA -Gehalts und mehr Membranstrukturen bessere Ergebnisse, Produktdiffusion verhindern. Jedoch, Dickere Abschnitte können die morphologische Beobachtungsqualität und -auflösung verringern.
Foliebehandlung:
- Vorbeugung der Gewebeablösung während der PCR und in situ-Hybridisierung durch Behandlung von Objektträgern mit Poly-L-Lysin oder Silanisierung.
Proteinase -Verdauung
Vor der In -situ -Verstärkung, Gewebeproben benötigen eine Proteinase -Behandlung. Proteinase -Verdauung erhöht die Zellpermeabilität, Reaktionskomponenten können Zellen eingeben und Zielsequenzen zur Amplifikation freilegen. Häufig verwendete Proteinasen umfassen Proteinase K., Trypsin, oder Pepsin. Das Ausmaß der Verdauung sollte basierend auf der Gewebefixierung eingestellt werden. Nach Verdauung, Stellen Sie sicher, dass die Enzyminaktivierung durch Erhitzen oder gründliches Waschen, Als Restenzyme können die Taq -DNA -Polymerase in der PCR -Reaktion zerstören.
Für und Wider:
- Die Verdauung erhöht die Permeabilität, Unterstützung nachfolgender Reaktionen
- Es kann auch die Wahrscheinlichkeit einer Produktdiffusion erhöhen, führt zu falsch positiven oder negativen.
In -situ -Amplifikation (PCR)
Die In -situ -Amplifikation bezieht sich auf die Durchführung der PCR -Reaktion direkt auf Gewebezellproben. Sein grundlegendes Prinzip ist völlig das gleiche wie das von PCR mit Flüssigkeitsphasen.
Grundierungen
Die in PCR verwendeten Primer sind typischerweise 15-30 Basispaare (bp) in Länge, und die verstärkten Fragmente sind ungefähr 100-1000 bp. Kürzere Primer sind für In -situ -PCR vorzuziehen. Aus Paraffinabschnitten extrahierte DNA ist selten vorbei 400 bp, und RNA ist selten vorbei 200 bp. Längere Sequenzen sind anfälliger für Fehlanpassungen zwischen Primern und Vorlagen, was zu unspezifischen Reaktionen führt.
Reaktionssystem
Das Reaktionssystem für In-situ-PCR ähnelt grundlegend der herkömmlichen Flüssigkeitsphasen-PCR. Jedoch, Da es auf festen Gewebeabschnitten durchgeführt wird, Um bessere Verstärkungsergebnisse zu erzielen, Es wird vermutet, dass die Konzentrationen von Primern, Taq-DNA-Polymerase, und mg²⁺ im Reaktionssystem sollte höher sein als die in der Flüssigphasen-PCR. Rinder -Serumalbumin (BSA) sollte dem Reaktionssystem hinzugefügt werden, um die Bindung von Taq -DNA -Polymerase an den Glasrutschen zu verhindern, Dies könnte die Amplifikationseffizienz verringern.
Thermalradfahren
Thermischer Radfahren für In -situ -PCR kann an einem spezialisierten thermischen Cycler durchgeführt werden, Welches ist einfach zu bedienen. Es kann auch an einem allgemeinen PCR -Wärmezycler durchgeführt werden, indem die Probenplattform mit einer Schicht Aluminiumfolie abdeckt, Füllen Sie den Raum auf der Probenplattform mit Mineralöl oder Wasser, und platzieren die Folien auf der Plattform, um die Thermalradschritte auszuführen.
Um eine ausreichende Verstärkung sicherzustellen, Die Dauer jedes Schritts im thermischen Radsportprozess für In -situ -PCR kann etwas länger sein als die für herkömmliche PCR. Zusätzlich, Die Hot Start -Methode kann angewendet werden, wobei der Objektträger auf 80-94 ° C erhitzt wird, bevor die Taq-DNA-Polymerase sofort hinzugefügt wird.
Um den Verlust des Reaktionssystems während des thermischen Radfahrenprozesses zu minimieren, Klarer Nagellack, Mineralöl, oder ein Pap -Stift kann verwendet werden.
Waschen
Nach der In -situ -Verstärkung, Die Probe sollte gewaschen werden, um die verstärkten Produkte zu entfernen, die außerhalb der Zellen diffundiert sind. Eine unzureichende Wäsche kann während der Erkennung zu sichtbaren verstärkten Produkten führen, verursachen einen hohen Hintergrund oder falsch-positiven Ergebnisse. Jedoch, Übermäßige Wäsche kann auch die verstärkten Produkte in den Zellen erfüllen, das positive Signal schwächen oder verlieren.
Einige Autoren empfehlen nach der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd für 2 Stunden oder 2% Glutaraldehyd für 5 Minuten nach der Verstärkung, um die amplifizierten Produkte innerhalb der Zellen während des Nachweiss zu halten, Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität.
In -situ -Erkennung
Die Methode zur Erkennung von In -situ -PCR -Amplifikationsprodukten hängt vom In -situ -PCR -Design ab. Die direkte Methode beinhaltet eine direkte In -situ -Erkennung basierend auf der Art der markierten Moleküle. Die indirekte Methode erfordert zur Erkennung in situ Hybridisierung.
Erkennung mit Fluorescein markiert, Biotin, Alkalische Phosphatase, oder Meerrettichperoxidase folgt den gleichen Prinzipien wie Immunhistochemie- und Affinitätshistochemie -Techniken.
Anwendungen der In -situ -PCR -Technologie
Der signifikante Vorteil der In -situ -PCR -Technologie ist die Fähigkeit, spezifische Gensequenzen mit niedrigen Kopienzahlen direkt in Gewebezellen nachzuweisen. Abhängig von der Art des getesteten Gens, Die Anwendungen der In -situ -PCR können in den Nachweis von exogenen und endogenen Genen unterteilt werden.
1. Nachweis von exogenen Genen
(1) Virusgenerkennung
Infizierte Zellen mit Viren fehlen häufig wirksame Nachweismethoden. Jedoch, Mit der Anwendung der In -situ -PCR -Technologie, Dieses herausfordernde Problem hat eine vielversprechende Lösung. Erkennen verschiedener Viren wie HIV, HPV, HSV, HBV, und HCV ermöglicht es uns, diese Viren zu beobachten‘ Rollen in AIDS, Tumoren des Fortpflanzungssystems, Hepatitis, und Leberkrebs und um infizierte Populationen umgehend zu identifizieren.
(2) Bakteriengenerkennung
Die bekannteste Anwendung ist der Nachweis von Mycobacterium tuberculosis. Wenn Tuberkulose -Läsionen atypisch sind, Es ist schwierig, Mycobacterium tuberculosis unter dem Mikroskop unter Verwendung von speziellen Färbemethoden zu finden. In -situ -PCR -Technologie kann dazu beitragen, eine endgültige Diagnose zu stellen, Auch wenn Mycobacterium tuberculosis knapp ist.
(3) Nachweis von eingeführten Genen
In der transgenen Tierforschung, bestätigen, ob ein Gen eingeführt wurde, und bei Patienten, die eine Gentherapie erhalten, Überprüfen Sie, ob das eingeführte Gen vorhanden ist, kann beide mit der In -situ -PCR -Technologie erreicht werden. Daher, In -situ -PCR ist zu einer wichtigen Erkennungsmethode geworden.
2. Nachweis von endogenen Genen
(1) Nachweis von abnormalen Genen
In -situ -PCR -Technologie kann Genmutationen und Umlagerungen im Körper nachweisen, wie Proto-Onkogen- und Tumorsuppressor-Genmutationen, und Immunglobulin -Gen -Genumlagerungen bei malignen Lymphomen. Dies bietet umfassende Anwendungsaussichten für Tumorforschung und Diagnose.
(2) Nachweis von intrinsischen Genen
Für intrinsische Gene mit niedrig exprimiertem Genen in Körperzellen mit nur einem oder wenigen Kopien, In -situ -Hybridisierungstechnologie ist aufgrund der niedrigen Genkopiezahl unwirksam. Während die Flüssigkeitsphasen-PCR diese Gene amplifizieren und nachweisen können, Es kann nicht den Zelltyp bestimmen, der das Gen enthält. Die In -situ -PCR -Technologie überwindet die Einschränkungen dieser beiden Techniken, Erlaubt uns, verschiedene menschliche Gene zu erkennen und die menschliche Genkarte zu vervollständigen.
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISCH)
Fluoreszenz -In -situ -Hybridisierung ist eine physikalische Kartierungsmethode, bei der fluoreszenzmarkierte Sonden zur Hybridisierung zwischen der Sonde und Chromosomen bei Metaphase oder Chromatin an der Interphase nachgewiesen werden.
In den späten 1980er Jahren entwickelt, Fische entwickelt sich von der radioaktiven In-situ-Hybridisierungstechnologie zu einer nicht radioaktiven molekularen zytogenetischen Technik, indem die Isotopenmarkierung durch Fluoreszenzmarkierung ersetzt wird. In Fisch, Die Sonde wird zuerst mit einem Reportermolekül kombiniert, das dann mit einem fluoreszierenden Farbstoff durch einen immunkytochemischen Prozess nach der Hybridisierung verbunden ist.
Das Grundprinzip von Fisch besteht darin, DNA zu kennzeichnen (oder RNA) Sonden mit speziellen Nukleotidmolekülen, hybridisieren diese Sonden direkt auf Chromosomen oder DNA -Faserabschnitte, und monoklonale Antikörper in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen verwenden, um spezifisch an Sondenmoleküle zu binden. Dies ermöglicht das Qualitative, Positional, und relative quantitative Analyse von DNA -Sequenzen auf Chromosomen oder DNA -Faserschnitten.
Fisch bietet Sicherheit, Geschwindigkeit, hohe Empfindlichkeit, Langzeit-Sondenerhaltung, und die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Farben anzuzeigen. Es kann sowohl Metaphase -Chromosomen als auch Interphasenkerne anzeigen. Außerdem, Multikolorfluoreszenz in situ Hybridisierung und Chromatinfaserfluoreszenz -In -situ -Hybridisierungstechniken wurden basierend auf FISH entwickelt.
Für rRNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Mehrere Faktoren können zu einer niedrigen Fluoreszenzsignalintensität führen:
- Niedriger zellulärer Ribosomengehalt
- Permeabilität mit niedriger Zellmembran
- Niedrige Zielsequenz -Zugänglichkeit aufgrund der rRNA -Faltung, wo einige Positionen eng mit anderen Ketten oder Proteinen gebunden sind, Verhinderung der Sonde nicht mit der Zielsequenz hybridisiert.
Um zu testen, ob die Zielsequenz in Zellen durch die Sonde leicht hybridisiert wird und die optimale Hybridisierungstemperatur bestimmen kann, „Klonfisch“ kann verwendet werden: rRNA -Gene werden in Plasmide eingebaut, ausgedrückt in e. Coli zur Bildung von Ribosomen, und dann hybridisiert mit fluoreszenzmarkierten Sonden.
Fische können auch mit der Durchflusszytometrie kombiniert werden, um spezifisch fluoreszenzmarkierte Zellen zu zählen oder zu isolieren.
