Restriktionsfragmentlänge Polymorphismus (RFLP) Versuchsverfahren für Schüler

ICH. Objektiv

Lernen und beherrschen Sie die Grundprinzipien und Erkennungsmethoden des Polymorphismus der Fragmentlänge der Fragmentlänge (RFLP) Genetische Marker.

II. Prinzip

Die erste Generation von molekularen genetischen Markern, RFLP, basiert auf Mutationen an den Restriktionsenzym -Schneidstellen in den Genomen verschiedener Sorten (Individuen). Diese Mutationen können Basisänderungen umfassen, Einfügungen, Löschungen, oder Umlagerungen zwischen den Enzym-Schnittstellen, was zu Variationen der Fragmentgrößen führt. Diese Variationen können durch erkannt werden PCR, Beschränkung der Beschränkung der Enzymverdauung, und Agarosegelelektrophorese, Ermöglichen des Vergleichs der DNA -Spiegelunterschiede (d.h., Polymorphismus) zwischen verschiedenen Sorten (Individuen). RFLP wurde häufig zur Konstruktion genomischer genetischer Karten verwendet, Genlokalisierung, Biologische Entwicklung und Klassifizierung, und Studien zur genetischen Vielfalt.

III. Instrumente, Materialien, und Reagenzien

Instrumente:

• Elektrische konstante Temperatur Wasserbad
• Agarosegelelektrophorese und Erkennungssystem

Materialien und Reagenzien:

• Hinter -III -Restriktionsenzym
• 10× m Puffer
• PCR -Produkt zu analysieren
• DL2000 -DNA -Marker
• 6× Ladepuffer
• Steriles doppeltes Wasser
• 1.5% Agarosegel (Notiz: Enthält Ethidiumbromid (Eb), Welches ist krebserregend; mit Handschuhen handhaben)
• 0.5% Tbe (Elektrophorese -Puffer)

Iv. Verfahren

1. Hind III -Restriktionsenzymverdauung

   • Reaktionsvolumen: 10 μl in a 0.2 ML Eppendorf Tube
   • Fügen Sie Folgendes hinzu, um die Reihenfolge zu erhalten:
     • 10× m Puffer: 1 μL
     • ddh2o: 5.5 μL
     • HIND III: 0.5 μL
     • PCR -Produkt: 3 μL
   • Verdauen bei 37 ℃ in einem Wasserbad für 2 Std.. Verwenden Sie das gesamte Verdauungsprodukt für die Erkennung von Agarosegel.

2. Agarosegelelektrophorese

   • Bereiten a 1.5% Agarosegel.
   • Mischen 10 μl des Verdauungsprodukts mit 1 μl Ladungspuffer.
   • Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 180 V durchführen.
   • DNA trägt eine negative Ladung, Es wird also während der Elektrophorese von der negativen zur positiven Elektrode wandern.
   • Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn die DNA auf migriert ist 1/2 Zu 2/3 der Länge des Gels. Unter einem UV -Detektor beobachten.

V. Abtretung

Schreiben Sie das detaillierte Verfahren dieses Experiments und beschreiben Sie die von Ihnen beobachteten Ergebnisse (einschließlich Zeichnungen).