Solarbio Superoxiddismutase (Seit) Aktivitätstest-Kit

Superoxiddismutase (Seit) Aktivitätstest-Kit

Notiz: Es ist notwendig, vorherzusagen 2-3 große Differenzproben vor der formalen Bestimmung.

Betriebsausrüstung: Spektrophotometer

Katze nein: BC0170

Größe: 50T/24s

Komponenten:

Extraktionsreagenz: 60 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz ⅰ: 15 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz ⅱ: 160 μL×1. Lagerung bei 4℃. Mischen Sie durch Pipettieren nach der Zentrifugation.

Reagenz ⅲ: 11 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz ⅳ: Pulver×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz V: 2 ml×1. Lagerung bei 4℃. Fügen Sie Reagenz ⅳ zu Reagenz V vor dem Gebrauch hinzu und schütteln Sie mit einem Oszillator, um sie gründlich zu mischen. Es kann gespeichert werden 3 Monate.

Produktbeschreibung:

Superoxiddismutase (Seit, EC 1.15.1.1) ist bei Tieren weit verbreitet, Pflanzen, Mikroorganismen und kultivierte Zellen. Es katalysiert das Superoxidanion, um H2O2 und O2 zu bilden. SOD ist nicht nur das Superoxid -Anion -Abren -Enzym, aber auch das Haupt -H2O2, das Enzym produziert, die eine wichtige Rolle im biologischen Antioxidationssystem spielt.

Superoxidanion (O2-) wird vom Xanthin- und Xanthinoxidase -Reaktionssystem produziert. O2- Kann blaue Tetrazol reduzieren, um blaue Formenazan zu erzeugen, das hat eine Absorption in 560 nm. Sod kann O2 entfernen- und hemmen die Bildung von Methionin. Je dunkler die blaue Farbe der Reaktionslösung, Je niedriger die Aktivität von SOD ist. Desto leichter die blaue Farbe der Reaktionslösung, Je höher die Aktivität von SOD.

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung:

Spektrophotometer, Tabelle Zentrifuge, Pipette übertragen, 1 ML Glass Cuvette, Mörtel/Homogenisator, Eis und destilliertes Wasser.

Betriebsschritte:

ICH. Probenvorbereitung:

1. Bakterien oder Zellen: Sammeln von Bakterien oder Zellen in die Zentrifugenröhre, Überstand nach Zentrifugation verwerfen. Gemäß dem Anteil von Bakterien oder Zellen (104 Zellen): Extraktionslösungsvolumen (ml) von 1:5-10 extrahieren. Es wird vorgeschlagen, dass 5 Millionen Bakterien oder Zellen sind mit 1 ml Extraktionsreagenz. Aufteilung der Bakterien oder Zellen mit Ultraschall (auf Eis gelegt, Ultraschallleistung 200W oder 20%, Arbeitszeit 3s, Intervall 10s, Wiederholen Sie 30 mal). Zentrifuge bei 8000 ×g für 10 Minuten bei 4 ℃, um unlösliche Materialien zu entfernen, und nehmen Sie den Überstand vor dem Testen auf Eis.
2. Gewebe: gemäß dem Anteil des Gewebgewichts (G): Extraktionslösungsvolumen (ml) von 1:5-10 extrahieren. Es wird vorgeschlagen, dass 0.1 G Gewebe mit 1 Ml des Extraktionsreagens und auf Eis vollständig homogenisiert.
3. Zentrifuge bei, 8000 ×g für 10 Minuten bei 4 ℃, um unlösliche Materialien zu entfernen, und nehmen Sie den Überstand vor dem Testen auf Eis.
4. Serum (Plasma) Probe: Probe direkt erkennen.

II. Bestimmung Verfahren:

1. Das Spektrophotometer vorheizen 30 Protokoll, Wellenlänge anpassen 560 NM und Null mit destilliertem Wasser einstellen.
2. Reagent halten ⅰ, Reagenz ⅲ, Reagenz V im Wasserbad für mehr als 5 Minuten bei 37 ℃(Säugetier) oder

25℃ (andere Arten).

3. Fügen Sie Reagenzien mit der folgenden Liste hinzu:

Reagens (μL)	Reagenzglas (T)	Steuerrohr (C)	Leeres Rohr (B1)	Leeres Rohr (B2)
Probe	90	90	–	–
Reagenz ⅰ	240	240	240	240
Reagenz ⅱ	6	–	6	–
Reagenz ⅲ	180	180	180	180
Destilliertes Wasser	480	486	570	576
Reagenz V	30	30	30	30

Gründlich mischen und die Mischung bei Raumtemperatur für inkubiert wird 30 Protokoll. Fügen Sie die Mischung in 1 ml Glasklausel hinzu, und den Absorptionswert jedes Röhrchens bei erkennen 560 nm. ΔAT = at-AC，ΔAB = AB1-AB2. Wenn am Boden Niederschläge vorhanden sind, gründlich mischen und dann messen.

III. Berechnung:

1. Hemmungsprozentsatz:

Hemmungsprozentsatz =[ΔAB -ΔAT]÷ ΔAB × 100%

The inhibition percentage should be in 30%~70% (der Wert nahezu 50% wird ein genaueres Ergebnis haben). Wenn der berechnete Hemmungsprozentsatz geringer ist als 30% oder mehr als 70%, Es ist normalerweise erforderlich, die Probenadditionsmenge anzupassen und zu bestimmen. Wenn der Prozentsatz der Hemmung zu hoch ist, Die Probe sollte ordnungsgemäß verdünnt werden. Wenn der Prozentsatz der Hemmung zu niedrig ist, Die Probe sollte mit einer höheren Konzentration wiedergegeben werden.

2. Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym katalysiert die Hemmung von 50% im Reaktionssystem der oben genannten Xanthin
3. Berechnung

A. Serum (Plasma)Probe

Seit (U/ml)=[P ÷(1-P)× VRV]÷ vs × f = 11,4 × p ÷(1-P)× f

B. Gewebe, Bakterien oder kultivierte Zellen

A) Proteinkonzentration:

Seit (U/ml prot) = [P ÷(1-P)× VRV]÷(Vs×Cpr)× F = 11,4 × P ÷(1-P)÷ CPR × f

B) Probengewicht

Seit (U/g-Gewicht) = [P ÷(1-P)× VRV]÷(W × vs ÷ vsv)× F = 11,4 × P ÷(1-P)÷ w × f

C) Bakterien oder Zellmenge

Seit (U/104 -Zelle)=[P ÷(1-P)× VRV]÷(500× vs ÷ vsv)× F = 0,0228 × P ÷(1-P)× f

Seil: Gesamtreaktionsvolumen, 1.026 ml; Vs: Probenvolumen, 0.09 ml;

VSV: Extraktionsvolumen, 1 ml;

Cpr: Proteinkonzentration der Probe, mg/ml; W: Probengewicht, G;

500: Gesamtzahl von Bakterien und Zellen, 5 Million. P: Hemmungsprozentsatz, %;

F: Probenverdünnung mehrere.

Notiz:

1. Die Probe und das Reagenz ⅱ sollten auf Eis gelegt werden, wenn
2. Wenn es viele Proben gibt, die Arbeitslösung (einschließlich Reagenz i, II und III) kann gemäß der Tabelle konfiguriert werden. Reagenz V muss hinzugefügt werden
3. Nach Abschluss der Reaktion, Es kann zu Niederschlägen gebildet werden, das kann nach dem Ermittlungen ermittelt werden

Experimentelle Beispiele:

1. 1 G von Echinochloa crusgalli wird hinzugefügt in 1 ML des Extraktionsreagens für die Homogenisierung. Nachdem der Überstand genommen wurde, Die Operation wird gemäß den Bestimmungsschritten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Δat = at – Ac = 0.335-0.012 = 0.323, ΔAB = AB1 - AB2 = 0.957-0.003 = 0.954. Hemmungsprozentsatz = (ΔAB- ΔAT)÷ ΔAB × 100% = 72%, und die Enzymaktivität wird gemäß der Probenmasse berechnet.

SOD -Aktivität (U/g-Masse) = 11.4 × Hemmungsprozentsatz (1-Hemmungsprozentsatz) × w = 293.14 U/g-Masse.

2. 1 Ml des Extraktionsreagens wird zugesetzt 0.1 G der Ratten Milz zur Homogenisierung. Nachdem der Überstand genommen wurde, Die Operation wird gemäß den Bestimmungsschritten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Δat = at- Ac = 0.563-0.213 = 0.35, ΔAB= AB1- AB2 = 0.957-0.003 = 0.954, Hemmungsprozentsatz = (ΔAB -ΔAT)÷ δab × 100% = 31%

SOD -Aktivität (U/g-Masse) = 11.4 × Hemmungsprozentsatz (1-Hemmungsprozentsatz) × w = 196.71 U/g-Masse.

3. 10 Millionen Zellen werden extrahiert und durch Zugabe zentrifugiert 1 ML des Extraktionsreagens, und dann wird die Operation gemäß den Bestimmungsschritten durchgeführt. Die Ergebnisse sind wie folgt: Δat = at – AC = 614-0.015 = 0.599, ΔAB= AB1- AB2 = 0.944-0.005 = 0.939, Hemmungsprozentsatz = (ΔAB- ΔAT) × ΔAB ​​× 100% = 36.21%

SOD -Aktivität (U/104 -Zelle) = Hemmungsprozentsatz ÷ (1-Hemmungsprozentsatz)× VTS]÷(1000× vs ÷ vts) = 0.0065 U/104 -Zelle.

Verweise:

• Spitz D r, Oberley L w. Ein Assay zur Superoxiddismutaseaktivität in Säugetiergewebe -Homogenaten[J]. Analytische Biochemie, 1989,179(1):8-18.
• Masayasu m, Hiroshi y. Eine vereinfachte Assay -Methode zur Superoxiddismutaseaktivität für den klinischen Einsatz[J]. Acta Chemical Clinic, 1979,92(3):337-342.

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