Solarbio oxidierte Glutathion (GSSG) Inhaltstest-Kit

Oxidiertes Glutathion (GSSG) Inhaltstest-Kit

Notiz: Nehmen Sie vor dem Test zwei oder drei verschiedene Proben zur Vorhersage.

Betriebsausrüstung: Spektrophotometer/Mikroplatten-Reader

Katalognummer: BC1185

Größe:100T/96S

Komponenten:

Reagenz I:100 ml×1. Lagerung bei 4℃. Reagenz II: 130 μL×1. Lagerung bei 4℃. Reagenz III: 20 ml×1. Lagerung bei 4℃. Reagenz IV:2.5 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz V: Pulver × 1. Lagerung bei 4℃. Mit auflösen 2.5 ml destilliertes Wasser, wenn die Lösung verwendet wird, Dann in kleinere Pakete aufgeteilt, Speichern Sie bei -20 ℃.

Reagenz VI:12.5 μL×1. Lagerung bei 4℃. Bereiten Sie das Reagenz VI und destilliertes Wasser gemäß der Probengröße im Verhältnis von vor 1:20 (V: V) vor dem Gebrauch.

Standard: Pulver 10 mg × 1. Lagerung bei 4℃.

Produktbeschreibung

Oxidiertes Glutathion(GSSG) ist eine oxidierte Form von Glutathion (GSH), auch als Dithioneglutathion bekannt, gebildet durch Oxidation von zwei Glutathionmolekülen. GSSG wird durch Glutathionreduktase auf GSH reduziert, Der größte Teil des Körpers ist also in reduzierter Form. Die Bestimmung des GSH- und GSSG -Gehalts und des Verhältnisses von GSH/GSSG in Zellen kann den Redoxstatus von Zellen widerspiegeln. Dieses Kit nutzt die Reaktion von Glutathion und 5, 5′-Dithiobis-2-Nitrobenoesäure (Dtnb) 5-thio-2 produzieren- Nitrobenzoesäure. 5-Thio-2- Nitrobenzoesäure hat die größte Absorption bei Wellenlänge von 412 nm, und 2-Vinylpyridin hemmen reduzierte Glutathion im Original von Proben, und dann verwenden Sie Glutathionreduktase, um GSSG auf GSH zu reduzieren, Bestimmung des Gehalts von oxidiertem Glutathion.

Technische Spezifikationen

Mindesterkennungsgrenze：3.211 μg/ml

Linearer Bereich：3.9-125 μg/ml

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung.

Analytisches Gleichgewicht, Mörtel/Homogenisator, Kühlzentrifuge, Wasserbad, verstellbare Pipette, Spektrophotometer/ Mikroplattenleser, Mikroglasküvette/96-Well-Platte mit flachem Boden.

Verfahren

ICH. Probe Vorbereitung

1. 1. Gewebeprobe

Waschen Sie frische Gewebe mit PBS für zweimal, dann hinzufügen 0.1 g Probe in den Homogenisator (Der Homogenisator wurde mit Reagenz I gespült und vor dem Gebrauch auf Eis gelegt). Hinzufügen 1 ml Reagenz I (Der Anteil von Gewebe und Reagenzien kann konstant gehalten werden), Volles Schleifen auf Eis (Die Verwendung von flüssigem Stickstoff hat einen besseren Schleifeffekt). Zentrifuge bei 8000 × g und 4 ℃ für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und platzieren Sie ihn bei 4 ℃ zur Prüfung. (Der Überstand kann bei -80 ℃ für aufbewahrt werden 10 Tage.)

2. Blutprobe

Plasma: Die Probe ist zentrifugiert bei 600 × g und 4 ℃ für 10 Protokoll. Das obere Plasma in ein anderes Rohr aufnehmen mit demselben Volumenreagenz i. Zentrifuge bei 8000 × g und 4 ℃ für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und platzieren Sie ihn bei 4 ℃ zur Prüfung. (Der Überstand kann bei -80 ℃ für aufbewahrt werden 10 Tage.)

Blutkörperchen:Die Probe ist zentrifugiert bei 600 × g und 4 ℃ für 10 Protokoll. Das obere Plasma wegwerfen, Waschen Sie mit einem Höhenvolumen von PBS für 3 mal (Mischen Sie die Blutkörperchen mit PBS -Zentrifuge bei 600 ×g für 10 Protokoll), Fügen Sie das gleiche Volumen des Reagenzs hinzu i. Nach dem Mischen, es wird bei 4 ℃ für platziert 10 Protokoll. Zentrifuge bei 8000 ×g für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und platzieren Sie ihn bei 4 ℃ zur Prüfung. (Der Überstand kann bei -80 ℃ für aufbewahrt werden 10 Tage.)

3. Zellprobe

Die Erntezelle sollte mindestens 106 und dann mit PBS für zweimal waschen (Zelle mit PBS -Zentrifuge bei 600 × g für mischen 10 Protokoll), Mischen Sie ausgefällte Zellen mit dem Volumen von PBS für 3 mal. 2–3 Mal wiederholtes Gefrieren und Auftauen (vorschlagen in flüssigem Stickstoff eingefroren, in 37 ℃ Wasserbad gelöst). Zentrifuge bei 8000 ×g für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und platzieren Sie ihn bei 4 ℃ zur Prüfung. (Der Überstand kann bei -80 ℃ für aufbewahrt werden 10 Tage.)

II. Verfahren

1. Vorheizen -Spektrophotometer/Mikroplattenleser für 30 Protokoll, Passen Sie die Wellenlänge an 412 nm, Stellen Sie den Zähler mit destilliert auf Null ein
2. Reagenz II in Wasserbad vorheizen 30 Protokoll: 37℃ (Säugetierzelle) oder 25 ℃ (andere Arten).
3. Die Standardverdünnung: Standard auflösen mit 1 ml destilliertes Wasser (4℃) zu einer Konzentration von 10 mg/ml. Nehmen Sie eine geeignete Lösung, um den Konzentrationsstandard von 125 μg/ml vorzubereiten、 5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml、7.8125μg/ml、3.90625μg/mland0 μg/ml (Der Verdünnung ist ein zehnfalisches verdünntes Reagenz I I.).

4. Hinzufügen 20 μl verdünnter Standard oder Probe bis 0.5 ML Zentrifugenröhre, hinzufügen 1 μl von Reagenz II II, inkubieren 37 ℃ für 30 Minuten nach dem Mischen.
5. Standardkurven machen

Nach der Inkubation, hinzufügen 140 μl von Reagenz III III, 20 μl Reagenz IV, 20μl von Reagenz V v, Und 2 μl Reagenz VI zum Standardrohr in Sequenz. Nach schnellem Mischen, die Lichtabsorption A1 und A2 von 30 s und 150 s wurden jeweils bei gemessen 412 nm. Absorption (A2-A1) ist die Abszisse (X) und Konzentration ist die Ordinate (y), die Standardkurve machen.

Hinzufügen 140 μl von Reagenz III III, 20 μl Reagenz IV, 20 μl von Reagenz V v, Und 2 μLOF -Reagenz VI zu den Probenröhrchen in Sequenz. Nach schnellem Mischen, die Lichtabsorption A1 und A2 von 30 s und 150 s wurden jeweils bei gemessen 412 nm, ΔA = A2- A1.

III. Berechnungen

Gemäß der Standardkurve, Probe ΔA in die Formel (X), Berechnen Sie die Probenkonzentration von y

(μg/ml).

• Proteinkonzentration

GSSH (μg / Mg Prot)= y × vrv ÷ vrv ÷ cpr = y ÷ cpr

• Probengewicht

GSSH (μg /g)= y × vrv ÷(VRV ÷ VSV × W.)= y ÷ w

• CellAmount

GSSH (μg /106 Zelle)= y × vrv ÷(VRV ÷ VSV × n)= y ÷ n

• Lösungsvolumen

GSSH (μg / ml)= y × vrv/vs = 2y

N: Zellmenge,106；

Seil: Gesamtreaktionsvolumen, 0.203 ml；

VSV: Das Volumen des Überstands wurde in das Reaktionssystem gegeben, 20 μl = 0,02 ml； W: Probengewicht, G;

Cpr: Überstandsproteinkonzentration, mg/ml.

Anmerkungen:

1. Die Probe muss vollständig homogenisiert werden. Wenn der Test nicht vorübergehend abgeschlossen werden kann, Es kann AT-80 ℃ gespeichert werden.
2. Wenn der Inhalt des GSSG -Inhalts in der Stichprobe ungewiss ist, Mehrere Gradienten können vor der Messung verdünnt werden.
3. Diese Methode verwendet die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit, um die Substratkonzentration zu berechnen und die Messwerte so genau wie möglich zu vervollständigen 30 Und 150
4. Reagenz I enthielt Proteinfeilbilder, Der Überstand konnte nicht zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet werden. Wenn der Proteingehalt bestimmt werden muss, Nehmen Sie ein weiteres Gewebe.

Referenz:

• Alpert a j, Gilbert H f. Nachweis von oxidiertem und reduziertem Glutathion mit einer Recycling -Postkolumnreaktion[J]. Analytische Biochemie, 1985, 144(2):553-562.
• Owens C w i, Belcher R Ein kolorimetrischer Mikro-Methode zur Bestimmung von Glutathion[J]. Biochemisches Journal, 1965, 94(3): 705.

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