Solarbio Laktatdehydrogenase (LDH) Aktivitätstest-Kit

Laktatdehydrogenase (LDH) Aktivitätstest-Kit

Notiz: Nehmen Sie vor dem Test zwei oder drei verschiedene Proben zur Vorhersage.

Betriebsausrüstung: Spektrophotometer/Mikroplatten-Reader

Katze nein: BC0685

Größe:100T/48S

Komponenten:

Lösung extrahieren: 60 ml×1. Lagerung bei 4℃；

Reagenz I: 7 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz II: Pulver × 1. Lagerung bei -20℃. Funktionierende Lösung: auflösen mit 1.3 ml destilliertes Wasser vor dem Gebrauch. Es kann nach dem Match in Tubula unterteilt werden, die für zwei Wochen bei -20 ℃ erhalten werden kann. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier- und Tauzyklen.

Reagenz III: 7 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Reagenz IV: 25 ml×1. Lagerung bei 4℃.

Natriumpyruvat -Standardlösung: 1 ml (2 μmol/ml) × 1. Lagerung bei 4℃.

Produktbeschreibung:

Laktat -Dehydrogenase (LDH oder LD) ist das terminale Enzym des Glykolysewegs, der in fast allen lebenden Zellen vorkommt (Tiere, Pflanzen, und Prokaryoten). LDH katalysiert die Umwandlung von Laktat in Pyruvsäure und Rücken, Da wandelt es NAD+ in Nadh und Rücken um.

NAD+ und Milchsäure werden durch Katalyse von LDH zu Pyruvsäure oxidiert. Pyruvat reagierte weiter mit 2,4-Dinitrophenylhydrazid zur Bildung von Pyruvat-Dinitrobenzon, die braune rote Farbe in alkalischer Lösung zeigen und die Farbtiefe ist proportional zur Pyruvatkonzentration.

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung:

Spektrophotometer/Mikroplattenleser, Thermostatwasserbad, Tischzentrifuge, verstellbare Pipette, Mikroglasküvette/96-Well-Platte mit flachem Boden, Mörtel/Homogenisator, Eis, destilliertes Wasser.

Verfahren:

ICH. Probe Vorbereitung:

1. Bakterien, Zellen, oder Gewebeprobe:

Bakterien oder Zellen:

Sammeln von Bakterien oder Zellen in die Zentrifugenröhre. Die Flüssigkeit in der oberen Schicht wird nach der Zentrifugation verworfen. Das Verhältnis von Bakterien/Zellmenge (104): Lösungsvolumen extrahieren (ml) ist 500 ~ 1000:1(es wird vorgeschlagen, herum zu nehmen 5 Millionen Bakterien/Zellen und hinzufügen 1 ml Extraktlösung). Bakterien und Zellen sind durch Ultraschall geteilt (auf Eis gelegt, 200W, Arbeitszeit 3s, Intervall 10s, Wiederholen Sie 30 mal). Zentrifuge bei 8000 Drehzahl 4 ℃ für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und legen Sie es auf Eis, um sie zu testen.

Gewebe:

Die Eisbad-Homogenität wird gemäß dem Verhältnis der Gewebemasse durchgeführt (G): Lösungsvolumen extrahieren (ml) = 1: 5~ 10 (Es wird empfohlen, ungefähr zu nehmen 0.1 G Gewebe und hinzufügen 1 ml Extraktlösung). Eisbad -Homogenisierung. Zentrifuge bei 8000 Drehzahl und 4 ℃ für 10 Protokoll, Nehmen Sie den Überstand und legen Sie es auf Eis, um sie zu testen.

2. Serum (Plasma)Probe:

Probe direkt erkennen.

II. Verfahren:

1. Vorheizen Sie den Spektrophotometer/Mikroplattenleser 30 Protokoll, Wellenlänge anpassen 450 nm, Mit destilliertem Wasser auf Null stellen.
2. Natriumpyruvat -Standardlösung: nehmen 100 μl Standardlösung, verdünnt zu 1, 5, 0.25, 0.125, 0 μmol/ml, und benutzen 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0 μmol/ml als Standardkurve.

3. Probentest

Reagenzname (μL)	Reagenzglas(Bei)	Steuerrohr(AC)	Standardrohr(Als)
Probe	10	10	–
Standardlösung	–	–	10
Reagenz I	50	50	50
Reagenz II	10	–	–
Destilliertes Wasser	–	10	10
Gründlich gemischt, bei 37 ℃ inkubieren(Säugetier) oder 25 ℃(andere Arten) Wasserbad für 15 Protokoll.
Reagenz III	50	50	50
Gründlich gemischt, bei 37 ℃ inkubieren(Säugetier) oder 25 ℃(andere Arten) Wasserbad für 15 Protokoll.
Reagenz IV	150	150	150

Gründlich gemischt, Bei Raumtemperatur legen für 3 Protokoll. Nehmen 200 μl Reaktionslösung in Mikroglaskuvette/96 gut mit flachem Bodenplatte, gemessen die Absorption bei 450 nm, ΔA = AT-AC. Jedes Testrohr sollte ein Steuerrohr einstellen.

III. LDH Berechnungen.

1. Probe Natriumpyruvatgehalt
2. Stellen Sie die Standardkurve ein, Y-Achse als Standardkonzentration, μmol/ml, X-Achse als die 450 NM -Absorption. ΔA setzen(X) in Standardkurve, berechnen y(μmol/ml)
3. Serum (Plasma) Probe LDH -Aktivität

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von katalysiert 1 Nmol von Pyruvinsäure pro Minute, Jeder Milliliter des Serums.

LDH(U/ml)= y ÷ t × 103 = 66,7 × y

4. Gewebe, Bakterien oder kultivierte Zellen LDH -Aktivität

A. Proteinkonzentration:

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von katalysiert 1 Nmol von Pyruvinsäure pro Minute, Jedes Milligramm Protein.

LDH(U/mg-Schutz)= y ÷ t ÷ CPR × 103 = 66,7 × y ÷ CPR

B. Probengewicht

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von katalysiert 1 Nmol von Pyruvinsäure pro Minute, In jedem Gramm Gewebe. LDH(U/g)= y ÷ t ÷ w × 103 = 666,7 × y

C. Zellmenge

Einheitendefinition: Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die die Produktion von katalysiert 1 Nmol von Pyruvsäure pro Minute alle 10000 Zellen.

LDH(U/104 -Zelle)= y ÷ t ÷ 500 × 103 = 0,133 × y

Vs: Über den Überblick (ml), 0.01 ml; VSV: Lösungsvolumen extrahieren, 1 ml; T: Reaktionszeit, 15 Protokoll;

Cpr: Proteinkonzentration der Probe, mg/ml; W: Probengewicht, 0.1 G;

500: Gesamtzahl von Bakterien oder Zellen, 5 Million; 103: 1 μmol/ml = 103 nmol/ml.

Verweise

[1] Huang p h, Fu l c, Huang C s, et al. Die Aufnahme von Oligogalacturonid und ihre Auswirkung auf die Wachstumshemmung, Lactat-Dehydrogenase-Aktivität und Galactin-3-Freisetzung menschlicher Krebszellen[J]. Lebensmittelchemie, 2012, 132(4): 1987-1995.

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