Katze nein: BC3830

Größe: 50T/48S

Lagerung： Die Reagenzien werden bei Raumtemperatur transportiert, nach Ankunft nach Ankunft gespeichert, und stabil im Inneren 0.5 Jahre.

Produktzusammensetzung

Reagenz ⅰ: 20 ml×1. Lagerung bei -20℃；

Reagenz ⅱ: 60 ml×1. Lagerung bei -20℃.

Reagenz ⅲ: 0.55 ml×1. Lagerung bei -20℃, Vermeiden Sie Licht. 5MM PNA Standard: 1 ml×1. Lagerung bei -20℃, Vermeiden Sie Licht.

Herstellung von Standardverdünnungen: nehmen 9 ml Reagenz ⅰ und hinzufügen 1 ml Reagenz ⅱ, gut mischen, und warten auf den Gebrauch. (Es kann auch gemäß dem Verhältnis von Reagenz ⅰ hergestellt werden ⅰ: Reagenz ⅱ = 9:1).

Produktbeschreibung:

Caspase ist eine Familie von Proteasen, die am Apoptoseprozess beteiligt sind, einschließlich mehr als 10 Mitglieder. Caspase-3 ist die wichtigste terminale Protease im Apoptoseprozess, Und es ist auch die am meisten untersuchte Caspase; Es aktiviert Pro-Caspase-2,6,7,9, Insbesondere hydrolysiert eine Vielzahl wichtiger apoptotischer Proteine, wie PARP, und vermittelt Chromatinkondensation, Apoptotische Körperbildung, und nukleare DNA -Fragmentierung.

Der Caspase-3-kolorimetrische Assay basiert auf der Hydrolyse des Peptid-Substrats devd-pNA (ASP- Glu-Val-Asp-P-Nitroanilid) von Caspase-3, durch die Freisetzung des P-Nitroanilin (PNA) Einheit. P- Nitroanilin hat eine hohe Absorption bei 405 nm. Die Aktivität von Caspase kann durch Nachweis von PNA berechnet werden. Dieses Kit ist für Säugetiergewebe und Zellen geeignet.

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung:

Spektrophotometer/Mikroplattenleser, 100μl Cuvette/ 96-Well-Platte, Zentrifuge, Wasserbad/Inkubator, verstellbare Pipette, Mörtel/Homogenisator, Eis, und destilliertes Wasser.

Verfahren:

A. Probenvorbereitung:

Zellen: Sammeln Sie die Zellen in das Zentrifugenröhrchen, Zentrifuge und Verwerfen des Überstands; Fügen Sie 100 μl Reagenz ⅱ zur Anzahl der Zellen hinzu (um 106 Zellen), Schütteln und resuspendieren Sie den Niederschlag resuspendieren, Dann stehe für 15 Minuten auf Eis, 15000g zentrifugieren bei 4 ℃ für 10 15 Mindest, Nehmen Sie den Überstand und legen Sie es auf Eis für (es kann erhöht werden auf 150-200 μl Reagenz ⅱ Wenn das Knacken nicht ausreicht)
Gewebe: Nach dem Verhältnis der Gewebemasse (G): Reagenz ⅱ Volumen (ml) von 1:5-10 (Es wird empfohlen, ungefähr abzuwägen 0.1 G Gewebe und hinzufügen 1 ml Reagenz ⅱ), Mahlen Sie es in ein Eisbad oder schneiden Sie es gründlich ab, Platzieren Sie es auf Eis für 15 Mindest, zentrifugieren es um 4 ℃ für 10-15 Mindest, Nehmen Sie den Überstand und legen Sie ihn zum Testen auf Eis.

B. Bestimmung Verfahren:

Heizen Sie das Spektrophotometer/Mikroplatten-Lesegerät vor 30 Protokoll, Passen Sie die Wellenlänge an 405 nm, und passen Sie das destillierte Wasser auf Null ein.
Vor Gebrauch, 5 Die mmol/l -PNA -Standardlösung wird verdünnt auf 200, 100, 50, 25, 5, Und 0 μmol/l Standardlösung mit Standardlösungsverdünnung.
Probenbestimmung (Fügen Sie die folgenden Reagenzien nacheinander in hinzu in 96 Brunnenplatte / Eptube)

Reagenzname （μl）	Reagenzglas (BEI)	Leeres Rohr (AB)	Standardrohr (ALS)
Reagenz I	40	40
Probe	50
Reagenz II		50
Reagenz III	10	10
Standardlösung			100
Gut mischen, Abdeckung 96 Gutteller fest, und Versiegelung mit Versiegelungsfilm. Inkubieren bei 37 ℃ für 60-120 Protokoll. Wenn die Farbänderung offensichtlich ist, die Absorption bei 405 NM kann bestimmt werden. Wenn die Farbänderung nicht offensichtlich ist, Die Inkubationszeit kann angemessen verlängert werden, Auch über Nacht. Leere Röhren müssen nur tun 1-2 mal. Berechnen Sie ΔAT = AT-AB.			Bestimmen Sie sofort die Absorption bei 405 nm

C. Aktivität Berechnung:

Einrichtung der Standardkurve

Die Standardgleichung erfolgt gemäß der Konzentration des Standardrohrs (X, μmol/l) und Δas (y, abzüglich der Röhre mit 0 Konzentration). Die Bestimmung von ΔAT wird in die Standardgleichung eingesetzt, um x zu erhalten (μmol/l).

Nach dem erhöhten Prozentsatz der Enzymaktivität

Erhöhter Prozentsatz der Caspase-3-Aktivität = ((experimentelle Behandlungsgruppe bei)- AB) / ((experimentelle Kontrollgruppe bei)- AB) × 100%

Die Methode ist einfach und zuverlässig und kann verwendet werden, um die Enzymaktivität grob zu bestimmen.

Berechnet durch Enzymaktivität

Eine Einheit ist die Menge an Enzym, die spaltet 1.0 nmol des kolorimetrischen PNA-Substrats pro Stunde bei 37 ℃ unter gesättigten Substratkonzentrationen. Wir können die Caspase -Aktivität in der Probe berechnen.

Caspase-3-Aktivität (U/mg-Schutz) = x × Vuial (VS × CPR ) ÷ t × 103 = 2x ÷ CPR ÷ t

Vr: Gesamtvolumen des Reaktionssystems, 0.1 ml = 10-4 L; Vs: Volumen der zusätzlichen Probe, 0.05 ml; T: Reaktionszeit, 1 H; Cpr: Probenproteinkonzentration, mg/ml; 103: Einheitsumwandlungskoeffizient, 1 μmol = 103 Nmol.

Notiz:

Seit dem Reagenz enthält ich einen Reduktionsmittel (DTT), Es wird empfohlen, die Probe zu verdünnen 2 Zeiten mit destilliertem Wasser und verwenden Sie dann die Bradford -Methode, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, um die Interferenz von DTT in die Proteinkonzentrationsbestimmung zu verringern. Es wird nicht empfohlen, die BCA -Methode zur Bestimmung des Proteins zu verwenden
Der häufigste Grund für den Wert niedriger Caspase -Aktivität ist, dass die Zellen keine Apoptose unterzogen haben, Die Menge der Zellen ist zu klein oder die Beobachtungszeit ist bei der Induktion der Apoptose, Es ist nicht so, dass je größer die Dosis ist, Je länger die Zeit, Je höher die Caspase -Aktivität. Es wird empfohlen, verschiedene Dosen und Zeitpunkte wie z. 0, 2, 4, 8, 16, Und 24 Stunden, um den besten Beobachtungspunkt zu erkennen.
Wenn der Wert der gemessenen Probe höher ist als die Obergrenze der Standardkurve, Die Probe kann mit Reagenz ⅱ verdünnt und dann erneut gemessen werden.
Decken Sie die 96-Well-Platte fest ab und versiegeln Sie sie mit Parafilm. Inkubieren 37 ºC, Der OD405 -Wert, wenn die Farbe gelb wird 0.2, das kann zu diesem Zeitpunkt gemessen werden. Die unbedeutende Farbänderung kann die Reaktion oder über Nacht verlängern, Aber wenn die Enzymaktivität stark ist, Zu lange Inkubationszeit führt dazu, dass die Reaktion den linearen Verlust verliert

Neuere Produktzitate：

Geld b , K , Jin t , et al. NCK1-AS1 verbessert die Gliomzellproliferation, Strahlung, und Chemoresistenz über den miR-22-3p/igf1r Cerna-Weg[J]. Biomedizin & Pharmakotherapie, 2020, 129:110395.
Wang z , Xu j h , Mou j j , et al. Neuartige ultrastrukturelle Erkenntnisse über Herz -Mitochondrien von Backbädern von BrandtsVolen in einer milden Kälteumgebung[J]. Vergleichende Biochemie und Physiologie – Teil A Molekular & Integrative Physiologie, 2020, 249:110766.

Verweise:

Cohen GM. Caspasen: die Henker der Apoptose. Biochem j, 1997, 326:1-16.
Janicker u, Sprrgart m l, Wati m r, ET aufkommende Rolle von Caspase-3 bei Apoptose[J]. Zelltod und Differenzierung, 1999, 6:99-104.

Solarbio Caspase-3-Aktivitätstest-Kit 50T | 48S

Beschreibung

Produktzusammensetzung

Produktbeschreibung:

Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung: