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Produkteinführung：
Dieses Reagenzienkit kann das konservierte CHD-W-Gen in Proben wie Federn verstärken und nachweisen, Blut, und Gewebe von Papageien, Dadurch wird ihr Geschlecht bestimmt. Durch die Einführung einer endogenen internen Referenz, Die Extraktions- und Amplifikationsprozesse der Nukleinsäuren können überwacht werden, um die Genauigkeit der Testergebnisse sicherzustellen.
Produktinhalte：
| Reagenzkomponenten | AN2304001-01 (24T) | AN2304001-02 (48T) |
| CW-Reaktionslösung | 23µL/Well×8Wells/Streifen×3Streifen | 23µL/Well×8Wells/Streifen×6stips |
| CW Positivkontrolle | 100μL | 100μL |
| Negativkontrolle | 100μL | 100μL |
Lagerbedingungen：
Bei -20℃ lagern, Die Haltbarkeit beträgt mindestens 12 Monate
Experimenteller Betrieb：
1. Probenvorbereitung (Probenvorbereitungsbereich)
1.1 Probenanforderungen：
Gefieder: Sammeln Sie zumindest 5 Federn aus der Brust, Abdomen, oder Beine (einschließlich des Federwellenteils), und verwenden Sie keine natürlich abgeworfenen Federn.
Blut: Verwenden Sie EDTA als Antikoagulans, Verwenden Sie Heparin nicht als Antikoagulans. Es sollte frisches Vollblut verwendet werden, oder es kann bis zu bei 2~8℃ gelagert werden 7 Tage, oder bei -20℃ für bis zu gelagert 3 Monate. Vermeiden Sie möglichst wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Gewebe: Nehmen Sie frisches Muskel- oder Organgewebe (Vermeiden Sie die Verwendung von Proben mit Haut, Sehnen, oder Faszien, die schwer zu bearbeiten sind) von nicht mehr als 100 mg. Bereiten Sie das Gewebehomogenisat mit 200–500 μl sterilem Wasser vor, und fahren Sie dann mit der anschließenden Probenvorbereitung fort.
1.2 Probenvorbereitung：
Bitte beziehen Sie sich auf die Three Lions Biotech „Kit zur schnellen Extraktion tierischer genomischer DNA (für PCR Analyse)“ Handbuch (Artikelnummer: DP202), oder andere Kits/Methoden zur Nukleinsäureextraktion, die die relevanten Anforderungen erfüllen, um die verarbeiteten Proben zu extrahieren. Legen Sie die extrahierte Nukleinsäureprobe in einen Kühlschrank und versuchen Sie, den Test umgehend fortzusetzen. Es kann bei 4°C bis zu gelagert werden 7 Tage oder bei -20°C für bis zu 6 Monate.
2 . Vorbereitung des Reaktionssystems (Reaktionsbereich zur Probenzugabe).
2.1 Nehmen Sie n+2 Reaktionsröhrchen mit der CW-Positivkontrolle heraus, CW-Negativkontrolle, und die für das Experiment benötigte Reaktionslösung (n stellt die Anzahl der zu testenden Proben dar, Plus 1 Positive Kontrolle, Und 1 Negativkontrolle). Tauen Sie die Reagenzien bei Raumtemperatur vollständig auf, Zentrifuge für 10 Sekunden, und schleudern Sie die Flüssigkeit innerhalb der Röhrchenwände und -kappen zum Boden des Röhrchens. Legen Sie sie zur späteren Verwendung in einen Kühlschrank.
2.2 Dann, 2 μL Negativkontrolle hinzufügen, extrahierte Probennukleinsäure, und CW-Positivkontrolle zur Reaktionslösung nacheinander. Schließen Sie die Tubenverschlüsse, ordentliche Aufzeichnungen machen, und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen jeder Reaktion 25 μl beträgt. Den Inhalt gründlich vermischen, Zentrifuge für 10 Sekunden, und fahren Sie dann mit dem Amplifikationsexperiment auf dem PCR-Gerät fort.
3. PCR-Amplifikation (Bereich Amplifikation und Produktanalyse).
Vordenaturierung bei 95°C für 3 Protokoll; Denaturierung bei 95°C für 10 Sekunden, Glühen und Streckung bei 58°C für 30 Sekunden, für 35 Fahrräder, Sammeln des Fluoreszenzsignals bei 58 °C. Der Fluoreszenzkanal 1 sollte auf FAM eingestellt sein (CHD-W-Gen), und Kanal 2 sollte auf VIC/HEX eingestellt sein (endogenes Referenzgen) (bei Verwendung des quantitativen Echtzeit-Fluoreszenz-PCR-Instruments der ABI-Serie, Falls benötigt, Wenden Sie sich im Voraus an den Hersteller oder fügen Sie den ROX-Kalibrierfarbstoff selbst hinzu; ansonsten, Folgen Sie dem normalen Verfahren).
4. Ergebnisermittlung
4.1 Wenn die Ct-Werte der Positivkontrolle sowohl im FAM-Kanal als auch im VIC/HEX-Kanal sind <28 und zeige ein „S“-geformte Verstärkungskurve, und die Negativkontrolle hat keinen Ct-Wert oder einen Ct-Wert ≥35 und nein „S“-geformte Verstärkungskurve, Das experimentelle Ergebnis ist gültig. Ansonsten, Der Versuch sollte wiederholt werden, und ob das Wiederholungsexperiment immer noch ungültig ist, Bitte wenden Sie sich an das technische Personal des Herstellers.
4.2 Der Ct-Wert der Probe im VIC/HEX-Kanal sollte ≤30 sein und einen Wert anzeigen „S“-geformte Verstärkungskurve, Dies zeigt an, dass die Probenextraktion und -verstärkung wirksam ist. Wenn kein Ct-Wert vorhanden ist oder der Ct-Wert vorhanden ist 30 < Ct ≤ 35 im VIC/HEX-Kanal, Dies weist darauf hin, dass die Nukleinsäureextraktion der Probe nicht dem Standard entspricht oder eine starke Hemmungsinterferenz vorliegt (wie Rückstände von Alkohol oder Desinfektionsmitteln, Antikoagulanzien, usw.) das hemmt die Verstärkung. Es wird empfohlen, die Probe für die Nukleinsäureextraktion und -amplifikation erneut aufzubereiten.
4.3 Nachdem die Erkennung im VIC/HEX-Kanal gültig ist, Die Bestimmung im FAM-Kanal erfolgt wie folgt:
- Ct-Wert ≤ 30 und ein „S“-Es wird eine geformte Verstärkungskurve beobachtet, und der Ct-Unterschied zwischen den beiden Kanälen ist kleiner als 5, es wird als positiv für das CHD-W-Gen festgestellt, Dies weist darauf hin, dass die Probe von einer Frau stammt.
- Ct-Wert ≤ 30 und ein „S“-Es wird eine geformte Verstärkungskurve beobachtet, aber der Ct-Unterschied zwischen den beiden Kanälen ist ≥ 5, oder Ct-Wert ist 30 < Ct < 32, Alle gelten als verdächtig, und ein erneuter Test wird empfohlen (Es wird empfohlen, zunächst auszuschließen „falsch positiv“ Ergebnisse, die durch eine Kontamination mit Aerosolen in der Umgebung verursacht werden, und fahren Sie dann mit der Nukleinsäureextraktion und dem Test fort). Wenn der erneute Test im FAM-Kanal nach Ausschluss einer Aerosolkontamination einen Ct-Wert zeigt < 30 und eine klare Verstärkungskurve, und der Ct-Unterschied zwischen den beiden Kanälen ist kleiner als 5, es wird als positiv für das CHD-W-Gen festgestellt; ansonsten, es wird als negativ bestimmt.
- Kein Ct-Wert oder Ct-Wert ≥ 32 und nein „S“-geformte Verstärkungskurve, es wird als negativ für das CHD-W-Gen festgestellt, Dies weist darauf hin, dass die Probe möglicherweise von einem Mann stammt.
Vorsichtsmaßnahmen：
1）Um eine Kontamination zu verhindern, Das Experiment sollte ausschließlich mit partitionierten Operationen durchgeführt werden. Um eine durch menschliche Faktoren verursachte Kreuzkontamination zu vermeiden, ist eine physische Isolierung zwischen den Trennwänden vorzuziehen. Tragen Sie während des Experiments Laborkittel und Latexhandschuhe, und separate Tools in verschiedenen Bereichen verwenden. Wechseln Sie bei Bedarf Handschuhe und Laborkittel. Nach der PCR, Öffnen Sie die Deckel nicht sofort. Warten Sie, bis das Gerät ausreichend abgekühlt ist, bevor Sie es zur Probenahme öffnen, um eine Aerosolkontamination zu minimieren.
2）Tauen Sie die Reagenzien vor der Verwendung vollständig auf, aber vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Befolgen Sie die Anweisungen zur Reagenzvorbereitung genau, Probenzugabe, und andere Schritte. Die Werkbank, Zentrifuge, Pipetten, und andere Instrumente sollten regelmäßig mit chlorhaltigen Desinfektionsmitteln desinfiziert werden, Ethanol, Mittel zur Entfernung von Nukleinsäurekontaminationen, oder UV-Lampen.
3）Ein negatives Ergebnis bedeutet nicht unbedingt, dass es sich um einen Mann handelt. Unbekannte Mutationen, schlechte Probenqualität, geringe Konzentration, oder das Vorhandensein stark hemmender Substanzen bei der Nukleinsäureextraktion (testen) kann auch dazu führen „Negativ“ Ergebnisse. Dieses Kit dient ausschließlich der spezifischen Amplifikation des CHD-W-Gens bei Papageien. Für andere Produkte, Bitte konsultieren Sie den Hersteller.
4）Dieses Produkt ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederholt einfrieren und auftauen. Es dient ausschließlich wissenschaftlichen Forschungszwecken und sollte nicht für die klinische Diagnose oder andere Zwecke verwendet werden.
